Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化小兒消積止咳制劑提取純化工藝△

高艷紅，劉金宇，曹玲，崔琳琳，關(guān)永霞*，張貴民

1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；

2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006

小兒消積止咳制劑（口服液/顆粒）組方來源于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科名老中醫(yī)畢可恩的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由山楂、檳榔、枳實(shí)、枇杷葉、瓜蔞、連翹、萊菔子、葶藶子、蟬蛻和桔梗10 味中藥制成，具有清熱肅肺、消積止咳的功效[1]，臨床上用于小兒飲食積滯、痰熱蘊(yùn)肺所致的咳嗽、喉間痰鳴、腹脹、口臭的治療[2]，療效顯著，填補(bǔ)了國內(nèi)治療小兒食積咳嗽中成藥的空白。文獻(xiàn)報(bào)道其與阿奇霉素聯(lián)合治療小兒支原體肺炎亦有很好的療效[3-5]。小兒消積止咳制劑的提取純化工藝主要為水提醇沉[2]，本研究在多年生產(chǎn)數(shù)據(jù)積累的基礎(chǔ)上，用SPSSAU 熵值法確定了各因素的權(quán)重，確定以辛弗林轉(zhuǎn)移率、柚皮苷轉(zhuǎn)移率和干物質(zhì)得率的綜合評分為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化[6]，最終得到了最佳提取純化工藝。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XS204 型電子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品辛弗林（批號：110727-201809，純度：99.5%）、柚皮苷（批號：110722-201815，純度：93.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

小兒消積止咳制劑提取液、醇沉液（中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 辛弗林的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品適量，加入50%的甲醇制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的溶液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：TURNER Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL）=15∶30∶55；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：224 nm。

2.1.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 柚皮苷的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇制成質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液/醇沉液適量（折合成品0.5支/袋），至50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（35∶65），流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：283 nm。

2.2.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 干物質(zhì)得率測定

干物質(zhì)得率測定方法參考《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）通則0831“干燥失重測定法”，精密量取提取液/醇沉液10 mL，稱量，記錄質(zhì)量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至質(zhì)量恒定，干燥器中冷卻至室溫，稱質(zhì)量，計(jì)算干物質(zhì)得率。

秦鐵崖不急不躁，依然用跳步和滑步來避開對方重拳，同時用快拳擊打?qū)Ψ剑g以龍爪手襲擾。有幾次，秦鐵崖的龍爪手已經(jīng)扣住對方手臂，誰知沒等他發(fā)力，對手故技重施，兩臂往上一振，肌腱鼓蕩，秦鐵崖便抓握不住。

2.4 評價指標(biāo)

《中國藥典》2020 年版一部小兒消積止咳口服液項(xiàng)下的含量測定項(xiàng)為辛弗林，小兒消積止咳顆粒的含量測定項(xiàng)為柚皮苷。此外，干物質(zhì)得率也是衡量工藝的重要指標(biāo)。根據(jù)多年生產(chǎn)數(shù)據(jù)，經(jīng)SPSSAU 熵值法計(jì)算確定，水提工藝綜合指標(biāo)（Y1）中辛弗林轉(zhuǎn)移率（R1）、柚皮苷轉(zhuǎn)移率（R2）、干物質(zhì)得率（R3）的權(quán)重系數(shù)分別為23.15%、21.98%、54.87%，醇沉工藝綜合指標(biāo)（Y2）中辛弗林轉(zhuǎn)移率（R4）、柚皮苷轉(zhuǎn)移率（R5）、干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率（R6）的權(quán)重系數(shù)分別為32.97%、38.48%、28.55%。

2.5 水提單因素試驗(yàn)

2.5.1 料液比對水提工藝的影響 固定提取時間為60 min，提取數(shù)為2次，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）對水提效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，料液比在1∶4～1∶8 時，料液比增加，Y1隨之增加，當(dāng)料液為1∶8～1∶10 時，Y1趨于穩(wěn)定。因此，選擇料液在1∶6～1∶8進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化水提工藝。

圖1 料液比對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（, n=4）

2.5.2 提取數(shù)對水提工藝的影響 固定提取時間為60 min，料液比為1∶8，考察提取數(shù)（1、2、3、4次）對水提效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，提取數(shù)在1～4 時，隨著提取數(shù)的增加，Y1先增加后略有降低。因此，選擇提取數(shù)在1～3 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化水提工藝。

圖2 提取數(shù)對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（, n=4）

2.5.3 提取時間對水提工藝的影響 固定料液比為1∶8，提取數(shù)為2 次，考察提取時間（30、60、90、120、150 min）對水提效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，隨著提取時間的增加，Y1先增加后降低。因此，選擇提取時間60～120 min 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化水提工藝。

圖3 提取時間對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（,n=5）

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝

2.6.1 水提方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述水提單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)。因素水平見表1，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2～3。

表1 小兒消積止咳制劑水提工藝因素水平

表2 小兒消積止咳制劑水提工藝Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6.2 水提模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程 ：Y1=57.58+5.79A+1.31B+1.03C+0.83AB -0.52AC-0.019BC-4.32A2-1.28B2-0.82C2，r=0.923 2。結(jié)果顯示，建立的回歸整體模型P<0.01。失擬項(xiàng)P>0.01，不顯著，模型成立。

A 和A22 個因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3 個因素對Y1的交互影響分別見圖4～6，可看出，A的響應(yīng)面曲線陡峭且等高線密集，因此，對水提效果影響最大的因素為料液比。

圖4 料液比和提取數(shù)對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

2.6.3 水提工藝驗(yàn)證 通過模型分析可以確定水提最佳工藝：料液比為1∶8，提取數(shù)為2.84 次，提取時間為99 min，此時Y1max=60.02。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，修正最佳提取工藝：料液比為1∶8，提取數(shù)為3次，提取時間為100 min。在該工藝下重復(fù)試驗(yàn)3 次，Y1分別為59.58、59.63、58.73，平均值為59.31，RSD 為0.85%，接近預(yù)測值，說明優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定可行。

表3 小兒消積止咳制劑水提工藝響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果

2.7 醇沉單因素試驗(yàn)

2.7.1 浸膏相對密度對醇沉工藝的影響 固定醇沉?xí)r間為24 h，醇沉醇度為60%，考察醇沉前浸膏相對密度（1.10、1.15、1.20、1.25、1.30）對醇沉效果的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著相對密度的提高，Y2先增加后降低。因此，選擇相對密度1.15～1.25進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化醇沉工藝。

圖5 料液比和提取時間對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

圖6 提取數(shù)和提取時間對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

圖7 浸膏相對密度對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響（,n=5）

2.7.2 醇沉醇度對醇沉工藝的影響 固定醇沉前浸膏相對密度為1.23，醇沉?xí)r間為24 h，考察醇沉醇度（50%、60%、70%、80%）對醇沉效果的影響，結(jié)果見圖8。由圖8 可知，隨著醇沉醇度的提高，Y2先增加后降低。因此，選擇醇沉醇度50%～70%進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化醇沉工藝。

2.7.3 醇沉?xí)r間對醇沉工藝的影響 固定醇沉前浸膏相對密度為1.23，醇沉醇度為60%，考察醇沉?xí)r間（12、24、36、48 h）對醇沉效果的影響，結(jié)果見圖9。由圖9 可知，隨著醇沉?xí)r間的增加，Y2先增加后趨于穩(wěn)定。因此，選擇醇沉?xí)r間12～36 h進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化醇沉工藝。

圖9 醇沉?xí)r間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響（,n=4）

2.8 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化醇沉工藝

2.8.1 醇沉方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述醇沉單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)。因素水平見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5～6。

表4 小兒消積止咳制劑醇沉因素水平

表5 小兒消積止咳制劑醇沉工藝Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 小兒消積止咳制劑醇沉工藝響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果

2.8.2 醇沉模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程：Y2=74.79+5.15D-0.83E-2.74F-1.88DE-4.11DF+2.22EF -9.73D2-6.38E2-6.39F2，r=0.971 5。結(jié)果顯示，建立的回歸整體模型其P<0.01，達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)P>0.01，不顯著，模型成立。由結(jié)果分析可知，以Y2為響應(yīng)值時，模型一次項(xiàng)影響順序分別為D>F>E，其一次項(xiàng)D、二次項(xiàng)DF、D2、E2、F2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），一次項(xiàng)F、二次項(xiàng)DE、EF 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3個因素對Y2的交互影響分別見圖10～12。

圖10 浸膏相對密度和醇沉醇度對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響

2.8.3 醇沉工藝驗(yàn)證 通過模型分析可以確定醇沉最佳工藝：浸膏相對密度1.218，醇沉醇度58.2%，醇沉?xí)r間19.68 h，在此條件下，評價指標(biāo)Y2max=76.28。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，修正最佳醇沉工藝為浸膏相對密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉?xí)r間20 h。在該工藝下重復(fù)試驗(yàn)3 次，Y2分別為76.16、75.19、75.87，平均值為75.74，RSD 為0.66%，接近預(yù)測值，說明模型可靠，優(yōu)選的醇沉工藝可行。

3 結(jié)論

小兒積食是指因食物積滯于內(nèi)而出現(xiàn)不思飲食、腹脹、腹痛、嘔吐等，嚴(yán)重影響小兒消化吸收及生長發(fā)育。目前，臨床西醫(yī)治療小兒急性支氣管炎伴積食主要以抗生素控制感染及對癥干預(yù)為主，可有效促進(jìn)患兒癥狀改善及病情恢復(fù)，但尚無法完全滿足臨床需求[7]。近年來，中醫(yī)藥在兒科疾病的診治中發(fā)揮著越來越重要的作用，中藥制劑可根據(jù)小兒的生理病理特點(diǎn)，發(fā)揮中醫(yī)整體觀念、辨證論治的優(yōu)勢，在改善臨床癥狀的同時減少病原體的侵襲，而且不良反應(yīng)較少[8]。小兒消積止咳制劑是一種具有清熱肅肺、消積止咳功效的中成藥，可用于治療小兒痰熱蘊(yùn)肺所致的咳嗽，在臨床中常與阿奇霉素聯(lián)合用于小兒支原體肺炎的治療，并取得了良好的療效[4]。

Box-Behnken 是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)方法，可通過多元二次回歸方程擬合多個因素與多個響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程數(shù)學(xué)模型尋求最佳條件和參數(shù)，從而獲得較為精確的最佳工藝參數(shù)和響應(yīng)目標(biāo)的最優(yōu)值[9]。近年來，該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于中藥及復(fù)方有效成分的提取純化工藝優(yōu)化。

本研究采用Box-Behnken 對小兒消積止咳制劑的提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，使處方中各藥的有效成分最大限度地溶出，并盡可能降低雜質(zhì)的含量，以增加制劑的穩(wěn)定性，提高臨床療效。最終優(yōu)選出的提取純化條件為料液比1∶8，提取數(shù)為3 次，提取時間為100 min，醇沉浸膏相對密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉?xí)r間20 h。經(jīng)驗(yàn)證，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)所得的小兒消積止咳制劑純化工藝穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性良好，為后續(xù)藥物制劑及臨床藥效的發(fā)揮提供參考。

圖11 浸膏相對密度和醇沉?xí)r間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響

圖12 醇沉醇度和醇沉?xí)r間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響