金鐵鎖種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)△

熊永興，曾宇君，蘇鈦，李云，周國(guó)華，楊成金*

1.云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111；

2.云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，云南 昆明 650111；

3.云南白藥集團(tuán)麗江藥業(yè)有限公司，云南 麗江 674100

種子是中藥材生產(chǎn)的源頭，種子檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的重要措施和手段[1]。目前，我國(guó)除人參、三七等種子有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)外，其他大部分中藥材種子的檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)還處于空白狀態(tài)。金鐵鎖為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根[2]，始載于明代蘭茂所著《滇南本草》[3]，俗稱獨(dú)定子、獨(dú)丁子、昆明沙參、金絲矮陀等，是中國(guó)稀有種和特有單種屬植物，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。其于1974 年載入《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》，之后進(jìn)入《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）1977 年版，具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、解毒消腫的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、胃脘冷痛、跌打損傷、外傷出血等[4-6]，是云南民間治療風(fēng)濕、跌打損傷的主要藥物之一。隨著野生資源的枯竭，金鐵鎖種植規(guī)模得到快速發(fā)展，但種源市場(chǎng)秩序混亂，種子質(zhì)量良莠不齊，種植效果差異較大[7-8]。為此，本研究參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》及相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，對(duì)金鐵鎖種子的凈度、千粒質(zhì)量、真實(shí)性鑒定、生活力的檢驗(yàn)方法及發(fā)芽條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，制定金鐵鎖種子的檢驗(yàn)方法，建立金鐵鎖種子的質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以期為金鐵鎖的規(guī)?；⒁?guī)范化種植提供參考。

1 材料

金鐵鎖主要分布在金沙江和雅魯藏布江沿岸海拔2000～3800 m 的礫石山坡或石灰質(zhì)巖石縫中，人工種植主要集中在云南西部和西北部，四川省的川西、甘孜、涼山及貴州省畢節(jié)地區(qū)[12-14]。本課題組對(duì)金鐵鎖的主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行實(shí)地走訪調(diào)查，在云南、四川采集樣品36 批，經(jīng)云南省藥物研究所邱斌正高級(jí)工程師鑒定為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的種子，種子信息見(jiàn)表1。

表1 金鐵鎖種子信息

KMnO4、NaClO、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MT204T 型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；D101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MGC-450HP 型光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 扦樣

按《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T 3543.3—1995）中四分法扦樣。

2.2 凈度分析

金鐵鎖為總狀花序，種子細(xì)小，采收時(shí)成熟度常不一致，飽滿與否難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。按《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T 3543.3—1995）中廣義凈度分析方法，每批樣品重復(fù)3次。

2.3 其他植物種子數(shù)目測(cè)定

按《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T 3543.3—1995）扦樣方法，每批樣品重復(fù)2次。

2.4 真實(shí)性鑒定

采用外觀形態(tài)觀察測(cè)量法，從混合樣品中隨機(jī)抽取100 粒凈種子逐粒觀察種子形態(tài)、大小、顏色、表面特征及其他情況，用數(shù)顯卡尺測(cè)量種子的長(zhǎng)、寬、厚，記錄數(shù)據(jù)，確定鑒別特征，每批樣品重復(fù)3次。

2.5 質(zhì)量測(cè)定

采用百粒法、五百粒法和千粒法測(cè)定種子質(zhì)量。百粒法：隨機(jī)從混合樣品中數(shù)取100 粒種子，稱質(zhì)量，重復(fù)8 次，計(jì)算RSD 及變異系數(shù)。五百粒法：隨機(jī)從混合樣品中數(shù)取500 粒種子，稱質(zhì)量，重復(fù)4 次，計(jì)算RSD 及變異系數(shù)。千粒法：隨機(jī)從混合樣品中數(shù)1000 粒種子，稱質(zhì)量，重復(fù)2 次，計(jì)算重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比。

2.6 含水量測(cè)定

采用（130±2）℃恒溫烘干法和（105±2）℃恒溫烘干法，每份試樣稱取種子樣品約4 g，重復(fù)3 次。連續(xù)稱質(zhì)量，以2次質(zhì)量之差<0.2%為恒重。

2.7 生活力測(cè)定

采用L16（43）正交設(shè)計(jì)，隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，常溫條件下用蒸餾水浸泡12 h，去除果皮和種皮，取出胚和子葉放入培養(yǎng)皿中，分別倒入0.15%、0.10%、0.05%、0.01% TTC 溶液，置于25、30、35、40 ℃避光恒溫培養(yǎng)箱染色，每1 h觀察1次并統(tǒng)計(jì)染色情況。每個(gè)處理100粒種子，重復(fù)3次。

2.8 發(fā)芽試驗(yàn)

2.8.1 發(fā)芽前處理 取金鐵鎖種子，分別用純化水、0.1%、0.2%、0.3% KMnO4和1.0%、2.5%、5.0%NaClO處理10 min，備用。

2.8.2 發(fā)芽條件選擇 取凈種子粒置濾紙和細(xì)砂上，分別在15、20、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱里光照12 h·d-1和黑暗處理，保持培養(yǎng)皿內(nèi)水分充足，每日查看并記錄種子發(fā)芽情況，隨時(shí)挑出腐爛種子并統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理100 粒種子，4 次重復(fù)。

2.9 種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

采用上述研究確定的檢驗(yàn)方法，對(duì)收集的36 份金鐵鎖種子進(jìn)行凈度、真實(shí)性、千粒質(zhì)量、含水量、生活力、發(fā)芽率測(cè)定。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、K-均值聚類分析和標(biāo)準(zhǔn)差分析，制定金鐵鎖種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

金鐵鎖種子凈度分析種子每批最大質(zhì)量為1000 g，送檢樣品最少為100 g，凈度分析樣品最少為10 g。

3.2 凈度分析

金鐵鎖種子平均凈度達(dá)87%，各組樣品種子質(zhì)量的差值均沒(méi)有偏離原始質(zhì)量的5%，檢驗(yàn)結(jié)果有效。

3.3 其他植物種子數(shù)目測(cè)定

平均每10 g 金鐵鎖種子含其他植物種子226.5 粒，平均每千克金鐵鎖種子含其他植物種子2265 粒，樣品其他種子數(shù)的組間差距為17，在容許差距范圍內(nèi)，檢驗(yàn)結(jié)果有效。

3.4 真實(shí)性鑒定

金鐵鎖種子為蒴果棒狀，種子狹倒卵形，長(zhǎng)約（5.24±0.48）mm、寬約（1.38±0.20）mm、厚約（0.97±0.13）mm，黃綠色。

3.5 質(zhì)量測(cè)定

結(jié)果顯示，百粒法和五百粒法的變異系數(shù)>4%，千粒法的變異系數(shù)<4%。因此，金鐵鎖種子質(zhì)量測(cè)定應(yīng)采用千粒法。金鐵鎖種子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金鐵鎖種子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

3.6 含水量測(cè)定

金鐵鎖種子采用低恒溫烘干法時(shí)，前4 h迅速失去水分，隨后失水緩慢，種子含水量趨于穩(wěn)定，7 h達(dá)到恒重，含水量為10.07%。高溫烘干法前2 h 種子迅速失水，隨后失水緩慢，種子含水量趨于穩(wěn)定，4 h 時(shí)達(dá)到恒重，含水量為10.35%。2 種方法比較，金鐵鎖種子含水量測(cè)定宜選擇高恒溫烘干法。金鐵鎖種子含水量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 金鐵鎖種子不同測(cè)定時(shí)間的含水量

3.7 生活力測(cè)定

3.7.1 生活力標(biāo)準(zhǔn)的確定 有生活力的金鐵鎖種子胚軸、子葉被TTC 溶液染為鮮紅色或淺紅色，染色均勻；無(wú)生活力的金鐵鎖種子胚軸、子葉完全不著色或著淺色，染色不均勻，或局部著色，著色較淺（圖2）。

圖2 金鐵鎖種子TTC染色效果

3.7.2 生活力測(cè)定影響因素 由表3 可以看出，對(duì)金鐵鎖種子著色的影響因素中，染色時(shí)間>染色溫度>TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各溫度、TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，金鐵鎖種子均表現(xiàn)出染色時(shí)間越長(zhǎng)染色效果越好；3 h內(nèi)，溫度越高著色率越高，但是隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)，30 ℃時(shí)染色率開(kāi)始升高，且低質(zhì)量分?jǐn)?shù)TTC表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)染色（表3）。因此，選擇0.01% TTC溶液、30 ℃下浸種6 h 作為金鐵鎖種子生活力測(cè)定的最佳條件。

表3 不同溫度、不同TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和不同染色時(shí)間對(duì)金鐵鎖種子的染色效果（, n=3）

表3 不同溫度、不同TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和不同染色時(shí)間對(duì)金鐵鎖種子的染色效果（, n=3）

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05；表4同。

3.8 發(fā)芽試驗(yàn)

3.8.1 發(fā)芽前處理 發(fā)芽前未進(jìn)行消毒處理的金鐵鎖種子霉?fàn)€率達(dá)36.5%，消毒處理后能有效降低種子霉?fàn)€率。其中，用2.5% NaClO 消毒處理的種子發(fā)芽率最高為89%，種子霉?fàn)€率最低為11%。故金鐵鎖種子發(fā)芽前應(yīng)先用2.5% NaClO 處理，以降低霉?fàn)€率。

3.8.2 發(fā)芽試驗(yàn)條件確定 金鐵鎖種子在濾紙和細(xì)砂上均能萌發(fā)，且在不同溫度和光照條件下，濾紙的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)較細(xì)砂均更高（除20 ℃黑暗條件下的發(fā)芽指數(shù)），所以濾紙更適合金鐵鎖種子的萌發(fā)；從濾紙各試驗(yàn)組的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)來(lái)看，除15 ℃黑暗條件下高于光照條件外，其余均表現(xiàn)出光照條件下較高，且可明顯看出20 ℃下最高（表4）。因此，20 ℃下，采用濾紙做發(fā)芽床，給予光照的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)最高，該條件最適用于金鐵鎖種子發(fā)芽。

表4 不同溫度、不同發(fā)芽條件下金鐵鎖種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果（,n=3）

表4 不同溫度、不同發(fā)芽條件下金鐵鎖種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果（,n=3）

3.8.3 發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間確定 金鐵鎖種子置發(fā)芽床后第四天開(kāi)始逐漸發(fā)芽，第七天后發(fā)芽速率明顯上升，15 d 后發(fā)芽率趨于平穩(wěn)，發(fā)芽基本結(jié)束。因此，整個(gè)發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間應(yīng)在第四至十五天，初次計(jì)數(shù)時(shí)間為4 d，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為16 d。

3.9 種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

本研究從扦樣、凈度分析、其他植物種子數(shù)目測(cè)定、真實(shí)性鑒定、質(zhì)量測(cè)定、含水量、生活力、發(fā)芽率8個(gè)指標(biāo)對(duì)金鐵鎖種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行研究，確定適用于金鐵鎖種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)方法，見(jiàn)表5。

表5 金鐵鎖種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

3.10 種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定

3.10.1 種子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)表5 所示的金鐵鎖種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，測(cè)定從主產(chǎn)區(qū)收集的36 份金鐵鎖種子的發(fā)芽率、生活力、含水量、千粒質(zhì)量、凈度、其他種子率6個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 36份不同來(lái)源的金鐵鎖種子質(zhì)量指標(biāo)分析結(jié)果

3.10.2 分級(jí)指標(biāo)的確定

3.10.2.1 相關(guān)性分析 對(duì)36 份金鐵鎖種子進(jìn)行相關(guān)性分析（Pearson），結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，有5 個(gè)測(cè)量指標(biāo)均表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。種子的生活力、千粒質(zhì)量和凈度對(duì)發(fā)芽率都有顯著的影響，千粒質(zhì)量和凈度間，凈度和其他種子率間也存在著較好的相關(guān)關(guān)系；含水量與各指標(biāo)間相關(guān)性不顯著，故不納入分級(jí)指標(biāo)。故可采用發(fā)芽率、生活力、千粒質(zhì)量、凈度和其他種子率5 個(gè)指標(biāo)作為金鐵鎖種苗質(zhì)量的分級(jí)指標(biāo)。

表7 36份不同來(lái)源的金鐵鎖種子質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)間的相關(guān)性分析

3.10.2.2K-均值聚類分析 由于JTS2016QN13 號(hào)種子生活力和發(fā)芽率明顯低于其他組，屬于不合格種子，故將其排除分級(jí)（后將分為不合格種子級(jí)別），剩下的35 組數(shù)據(jù)針對(duì)發(fā)芽率、生活力、千粒質(zhì)量、凈度和其他種子率采用K-均值聚類進(jìn)行分析，將種子質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 金鐵鎖種子各指標(biāo)K-均值聚類分析結(jié)果

3.10.3 質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)定方法 由于其他種子數(shù)是不易控制的變量，差異巨大，不宜將其作為分級(jí)的主要參考項(xiàng)目，故以金鐵鎖種子發(fā)芽率、生活力、千粒質(zhì)量和凈度4 項(xiàng)指標(biāo)的K聚類中心值作為金鐵鎖種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的主要參考值，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和檢驗(yàn)的可操作性，最終制定的金鐵鎖種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表9。該分級(jí)方法采用最低定級(jí)原則，即任何一項(xiàng)指標(biāo)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能作為相應(yīng)等級(jí)的合格種子。

表9 金鐵鎖種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

4 討論

近年，金鐵鎖種子產(chǎn)量大，各地主要采用種子直播的生產(chǎn)方式。種子是金鐵鎖藥材規(guī)范化生產(chǎn)的首要條件和基礎(chǔ)，優(yōu)質(zhì)的種子對(duì)穩(wěn)定和提高金鐵鎖藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量起著極為重要的作用。建立金鐵鎖種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將為金鐵鎖的規(guī)范化生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。

在種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的4 個(gè)參考指標(biāo)中，發(fā)芽率、生活力最為重要，可以直接反映種子在田間的用量和出苗率，是實(shí)現(xiàn)種子效能的一個(gè)重要指標(biāo)；千粒質(zhì)量可反映種子成熟度和幼苗的長(zhǎng)勢(shì)等情況。雖然，凈度和其他種子數(shù)、含水量的高低不是種子生物學(xué)特性所決定的，對(duì)種子質(zhì)量的影響較小，但金鐵鎖為草本植物，且種子顆粒較小，采收加工時(shí)極易引入其他種子，易受人為因素和客觀因數(shù)的影響，播種后不易控制雜草，增加除草的困難，因此在制定金鐵鎖種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)將凈度作為一個(gè)重要指標(biāo)進(jìn)行考慮。此外，發(fā)芽率的測(cè)定也需要在凈度的基礎(chǔ)上進(jìn)行，所以凈度對(duì)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等級(jí)的劃分具有重要的參考作用。種子含水量與種子發(fā)芽率無(wú)顯著相關(guān)性，只與種子的安全貯藏和種子壽命相關(guān)，一般情況下在干燥低溫條件下貯藏都有利于保持種子的活力。因此，把發(fā)芽率、生活力、千粒質(zhì)量、凈度作為金鐵鎖種子質(zhì)量分級(jí)的重要指標(biāo)。其他種子數(shù)雖然與種子質(zhì)量存在相關(guān)性，但因其受人為影響較大，可以通過(guò)后期加工改變，故不作為分級(jí)的主要參考項(xiàng)目。