遠(yuǎn)志黃曲霉毒素檢測及其貯藏過程中黃曲霉菌變化研究△

常曉茜，姜丹，王鈞楠，李婷，任廣喜，米久，金敏，華國棟，劉春生*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000；

3.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039；

4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門醫(yī)院，北京 100700

遠(yuǎn)志是遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志P.sibiriaL.的干燥根，性溫，味辛、苦，歸心、腎、脾經(jīng)，具有安神益智、祛痰、消腫的功效[1]。在臨床使用中，遠(yuǎn)志的需求量很大，是大宗中藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，列為上品。然而，近年來遠(yuǎn)志的黃曲霉毒素（aflatoxins）超標(biāo)問題直接影響了其臨床使用的安全性。黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）等曲霉屬真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有致畸、致癌、致突變等作用，嚴(yán)重危害人體和動物的健康[3]。因此《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定了黃曲霉毒素作為遠(yuǎn)志的檢查項(xiàng)目[1]，限度要求為黃曲霉毒素B1不得超過5 μg·kg-1；黃曲霉毒素總量[黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）]不得超過10 μg·kg-1。遠(yuǎn)志屬于黃曲霉毒素檢出率較高的藥材，污染主要產(chǎn)生于遠(yuǎn)志的種植、采收、加工和貯藏等過程中[4]。

在遠(yuǎn)志的產(chǎn)地采收加工及運(yùn)輸貯藏過程中，極易由于操作不當(dāng)使遠(yuǎn)志筒不能及時(shí)干燥，導(dǎo)致黃曲霉菌在筒內(nèi)部繁殖，若儲存過程中環(huán)境潮濕陰暗，則會加劇黃曲霉菌的繁殖，易造成黃曲霉毒素超標(biāo)[5]。田洪嶺等[6]發(fā)現(xiàn)，藥農(nóng)在采收遠(yuǎn)志后，為了防止其水分蒸發(fā)，常用封閉的塑料袋保存新鮮遠(yuǎn)志條，高溫密閉易使遠(yuǎn)志藥材表面滋生黃曲霉菌，進(jìn)而導(dǎo)致黃曲霉毒素超標(biāo)。本課題組通過調(diào)研得知，遠(yuǎn)志在北京臨床應(yīng)用比較廣泛。本研究對12 批不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志進(jìn)行黃曲霉毒素含量的測定，同時(shí)觀察在北京貯藏過程中不同時(shí)間遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的變化，探究貯藏過程對遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的影響，以期為科學(xué)防控遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染提供參考。

1 材料

1.1 試藥

12批遠(yuǎn)志藥材，7批來自山西，其余5批分別來自河北、陜西、河南、內(nèi)蒙古、貴州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，具體信息見表1。

表1 遠(yuǎn)志樣品信息

真菌基因組DNA 快速提取試劑盒（批號：3621755）、2×TaqPCR MasterMix（批號：MT201-02）均購于北京博邁德科技發(fā)展有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；黃曲霉毒素混合對照品溶液（批號：610001-201703，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、甲酸均為質(zhì)譜級（美國Fisher 公司）；色譜級甲醇（北京市通廣精細(xì)化工公司）；氯化鈉（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器

Xevo TQS Micro型超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）均購自美國Waters 公司；YXQ-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫(yī)療有限公司）；GL-88B 型渦旋振蕩器（海門市斯林貝爾儀器制造有限公司）；XSP-44X.9型顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）；3K15 型低溫高速離心機(jī)（德國Sigma 公司）；TProfessional Standard Gradient 96 型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）熱循環(huán)儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；FMB40 型雪花制冰機(jī)（上海比朗儀器有限公司）；BG-gds AUTO520 型凝膠成像系統(tǒng)（南京華奧儀器有限公司）；MM400 型混合球磨儀（上海弗爾德萊馳有限公司）；JY-SP3型電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；P2161E25 型免疫親和柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的鑒定

2.1.1 黃曲霉菌株培養(yǎng) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g 洗凈削皮，切成小塊，加入去離子水1000 mL煎煮30 min，8層紗布濾過，加入無水葡萄糖20 g，瓊脂18 g，攪拌溶解，115 ℃滅菌20 min后分裝，備用。

將遠(yuǎn)志藥材去除雜質(zhì)后混勻，隨機(jī)稱取1 g放入無菌離心管中，加入無菌水10 mL，渦旋混勻15 min，超聲15 min，充分混勻后取500 μL 均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)7 d，采用菌絲頂端純化法，挑取培養(yǎng)基中形態(tài)上與黃曲霉菌相似的菌落接種至新的PDA 培養(yǎng)基，28 ℃避光培養(yǎng)7 d，對獲得的黃曲霉菌菌株進(jìn)行形態(tài)、顯微及DNA分子鑒定。

2.1.2 形態(tài)鑒定 根據(jù)《真菌鑒定手冊》[7]進(jìn)行真菌的形態(tài)特征鑒定。

2.1.3 顯微鑒定 無菌接種環(huán)挑取少量真菌置于載玻片上，用適量乳酸酚棉藍(lán)染色液滴至載玻片上，染色30 s后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

2.1.4 DNA 分子鑒定 用無菌接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面的真菌置于1.5 mL 離心管，加入液氮，使用球磨儀磨碎。參照真菌基因組DNA 快速提取試劑盒說明書提取菌落DNA。PCR 反應(yīng)體系為DNA 模板1 μL、引物各1 μL、2×TaqPCR Master聚合酶15 μL、雙蒸水12 μL，體系總體積30 μL。引物序列為ITS1：5′-AGAAGTCGTAAGGTTTCCGT-3′，ITS4：5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性90 s，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用ContigExpress 軟件對測序得到的正反向序列進(jìn)行拼接及人工校對。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，用DNAMAN進(jìn)行相似度分析，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建臨接（neighbor joining，NJ）樹進(jìn)行鑒定。

2.2 遠(yuǎn)志黃曲霉毒素測定

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，90%A；0.5～6.0 min，90%～10%A；6～7 min，10%A；7～9 min，10%～90%A；9～10 min，90%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 以三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；電噴霧離子源（ESI），采集模式為正離子模式；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為1000 L·min-1；毛細(xì)管電壓為0.50 kV[8]。各化合物檢測離子對和碰撞電壓見表2。

表2 遠(yuǎn)志中黃曲霉毒素質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2.3 混合對照品溶液制備 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標(biāo)示質(zhì)量濃度分別為1.09、0.39、0.99、0.64 μg·mL-1）適量，用70%甲醇稀釋成AFB2、AFG2質(zhì)量濃度為0.38～160.00 ng·mL-1，AFB1、AFG1質(zhì)量濃度為0.13～68.13 ng·mL-1的系列對照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 遠(yuǎn)志供試品溶液的制備參照《中國藥典》2020 年版黃曲霉毒素測定法（通則2351）進(jìn)行。

2.2.5 樣品測定 樣品測定方法參考廖權(quán)豐等[7]的研究，分別精密吸取2.2.3 項(xiàng)下系列混合對照品溶液各2 μL，注入超高效液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，測定峰面積，以待測黃曲霉毒素定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），黃曲霉毒素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取供試品溶液2 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。

2.3 不同時(shí)段遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的培養(yǎng)

將12 批不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志藥材用牛皮紙袋包裝，貯藏于北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)鎮(zhèn)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，每個(gè)月按2.1項(xiàng)下的稀釋平板法培養(yǎng)其表面的黃曲霉菌，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別記錄北京2019年不同時(shí)間段（6―12月）遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的鑒定

將遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，其在PDA 平板上生長迅速，顏色由黃綠色變?yōu)辄S色，可見黃色粉末，見圖1。顯微鏡下可見分生孢子頭呈疏松放射狀，分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，末端有近球狀或球狀膨大的頂囊，視野中可見大量球形或近球形的孢子，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。該菌的PCR 產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)觀察到條帶清晰明亮，構(gòu)建NJ樹，見圖2。綜上結(jié)果表明，該菌與黃曲霉菌聚為一支，鑒定為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）。

圖1 遠(yuǎn)志表面真菌、黃曲霉菌的培養(yǎng)平板及顯微觀察

圖2 遠(yuǎn)志中黃曲霉菌的NJ樹

3.2 遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染情況

3.2.1 黃曲霉毒素的MRM 色譜圖 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖見圖3。

圖3 遠(yuǎn)志中4個(gè)黃曲霉毒素的MRM色譜圖

3.2.2 線性關(guān)系及檢出限 黃曲霉毒素質(zhì)量濃度與定量離子峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，見表3。

表3 遠(yuǎn)志中4個(gè)黃曲霉毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)

3.2.3 精密度試驗(yàn) 取黃曲霉毒素的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次2 μL，分別計(jì)算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積RSD 為0.97%、1.03%、0.88%、1.25%，表明儀器精密度好。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次已知含量藥材粉末6 份，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜質(zhì)譜條件檢測，進(jìn)樣量為2 μL，依據(jù)回歸方程計(jì)算黃曲霉毒素的含量，AFB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為3.29 μg·kg-1，RSD為1.02%。

3.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的藥材粉末6份，精密稱定，分別加入黃曲霉毒素混合對照品溶液，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μL，測得AFB1的加樣回收率為89.3%，RSD 為2.78%、AFB2的加樣回收率為84.9%，RSD 為1.98%；AFG1的加樣回收率為83.1%，RSD 為2.43%；AFG2的加樣回收率為85.3%，RSD為2.83%。

3.2.6 遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染情況 在12 批不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志中均檢出AFB1，檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75～7.77 μg·kg-1，其中1 批樣品（河北邢臺）還檢測出AFG1，檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.60 μg·kg-1，AFB2和AFG2均未檢出。4 批（山西運(yùn)城2 批，河北邢臺、河南洛陽各1 批）遠(yuǎn)志的AFB1含量超過《中國藥典》2020年版限量標(biāo)準(zhǔn)，其中1批樣品（河北邢臺）的AFB1和黃曲霉毒素總量均超過《中國藥典》2020年版限量標(biāo)準(zhǔn)，具體結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志表面黃曲霉毒素質(zhì)量分?jǐn)?shù) μg·kg-1

3.3 遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌隨貯藏時(shí)間變化情況

12 批不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志表面均分離到黃曲霉菌，黃曲霉菌污染率為100%，見圖4。其中7―9 月遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量最多，6 月與10 月遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量最少，見表5。

表5 不同貯藏時(shí)間遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量 CFU·g-1

圖4 不同貯藏時(shí)間遠(yuǎn)志表面的真菌

北京2019 年6―12 月的溫濕度與遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌數(shù)量的變化情況如圖5 所示，遠(yuǎn)志藥材儲存地點(diǎn)的溫濕度條件與外界環(huán)境一致。

圖5 北京2019年6—12月溫、濕度與遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌數(shù)量變化

4 討論

2017—2018 年全國藥品質(zhì)量專項(xiàng)抽檢公告[10]的共計(jì)21 批遠(yuǎn)志樣品中，黃曲霉毒素含量不合格率高達(dá)90.5%，嚴(yán)重影響了遠(yuǎn)志的臨床使用。本研究采用UPLC-MS/MS 檢測了12 批不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12批遠(yuǎn)志的黃曲霉毒素污染率為100%，按照《中國藥典》2020 年版遠(yuǎn)志項(xiàng)下的規(guī)定，33.3%的樣品超過了AFB1和黃曲霉毒素總量限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，山西省運(yùn)城市聞喜縣作為遠(yuǎn)志的道地產(chǎn)區(qū)，在測定的7 批藥材中有2 批AFB1含量超標(biāo)，以上結(jié)果更進(jìn)一步說明了遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染問題的嚴(yán)重性。

遠(yuǎn)志的采收及加工過程中容易因干燥不及時(shí)而滋生黃曲霉菌[11]。張西梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，田間生產(chǎn)和采收加工都有可能造成遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染，而貯藏過程對其變化的影響尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)研究了北京不同時(shí)間的貯藏過程對遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的影響。分析發(fā)現(xiàn)，6—9 月北京的溫度、濕度都處于較高的狀態(tài)，遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量最多；11、12 月溫、濕度最低，遠(yuǎn)志表面黃曲霉菌的數(shù)量處于較低的水平。徐圓程等[13]利用高通量測序技術(shù)分析貯藏稻谷中的群落結(jié)構(gòu)，指出不同貯藏條件下稻谷真菌群落多樣性存在差異，優(yōu)勢菌屬發(fā)生變化。本研究中，10 月遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌數(shù)量最少，之后有所回升。推測可能是由于季節(jié)變換，氣溫驟降，優(yōu)勢菌群快速生長，不利于黃曲霉菌的生長所致，后期需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，探究不同貯藏條件下遠(yuǎn)志表面菌群的群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌屬。調(diào)查結(jié)果為制定合理的遠(yuǎn)志貯藏條件提供了一定的參考。特別是在炎熱悶熱的夏季，遠(yuǎn)志貯藏應(yīng)保持通風(fēng)的條件。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS測定了12批不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志黃曲霉菌的污染情況，并對北京不同時(shí)間下遠(yuǎn)志表面的黃曲霉菌生長情況進(jìn)行研究，后續(xù)將進(jìn)一步考察具體的貯藏條件對遠(yuǎn)志黃曲霉毒素含量的影響，深入研究遠(yuǎn)志黃曲霉毒素污染問題。