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    結(jié)構(gòu)光照明顯微的結(jié)構(gòu)光空間頻率和相位測定算法

    2021-12-26 11:02:52張尹馨鄧嘉俊費(fèi)建陽
    關(guān)鍵詞:空間頻率頻譜分量

    張尹馨,鄧嘉俊,費(fèi)建陽

    (1. 光電信息教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津大學(xué)),天津300072;2. 天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院,天津300072)

    在生命科學(xué)研究領(lǐng)域,超分辨顯微成像技術(shù)蓬勃發(fā)展,并且獲得了超過衍射極限的成像分辨率[1-3].在這些技術(shù)中,結(jié)構(gòu)光照明顯微(structured illumination microscopy,SIM)因?yàn)槠涑上袼俣雀?、光毒性低和對熒光特性要求少等?yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[4-7].在SIM 中,使用周期性的結(jié)構(gòu)光照明樣品后,可以將原本位于光學(xué)傳遞函數(shù)(optical transfer function,OTF)支持域外的高頻信息移動到OTF 支持域內(nèi),此時被移動的高頻信息與低頻信息混合形成混頻信息.圖像重建算法可分離低頻和高頻信息,并將高頻信息移位,使之與低頻信息合并形成擴(kuò)展頻譜.最后對拓展頻譜進(jìn)行傅里葉逆變換得到重建的超分辨圖像[8-10].

    準(zhǔn)確測定結(jié)構(gòu)光的相位和空間頻率對于分離和移動高頻信息至關(guān)重要,也是重建超分辨率圖像的關(guān)鍵[11-13].有關(guān)空間頻率和相位測定算法已有諸多報道,如迭代自相關(guān)算法(iterative auto-correlation algorithm,IAC)、迭代正弦相關(guān)算法(iterative sinusoidal correlation algorithm,ISC)[14]、峰值相位算法(phase of the peaks algorithm,POP)[15]、自相關(guān)算法(autocorrelation algorithm,AC)[16]和頻譜分量互相關(guān)算法(spectral-components cross-correlation algorithm,SCC)等[17-18].在結(jié)構(gòu)光調(diào)制度較高時,這些算法均能準(zhǔn)確計(jì)算結(jié)構(gòu)光的空間頻率和相位,然而并非所有SIM系統(tǒng)都能獲得理想的結(jié)構(gòu)光調(diào)制度.投影式SIM 系統(tǒng)[19]因其結(jié)構(gòu)簡單,圖像采集速度快,相比結(jié)構(gòu)復(fù)雜的干涉式SIM 系統(tǒng)[20]應(yīng)用更為廣泛.但是投影式 SIM 系統(tǒng)所生成的結(jié)構(gòu)光調(diào)制度會受到物鏡OTF 的影響,且隨著結(jié)構(gòu)光空間頻率和成像深度的增加而減?。送?,當(dāng)前SIM 系統(tǒng)逐步小型化,從實(shí)驗(yàn)室走向便攜式應(yīng)用也成為可能,光學(xué)結(jié)構(gòu)由于震動產(chǎn)生移位會使得結(jié)構(gòu)光調(diào)制度降低.因此,解決低調(diào)制度下的結(jié)構(gòu)光空間頻率和相位的準(zhǔn)確測算問題不可或缺,算法不僅要保證估算精度,還要具備廣泛適應(yīng)性.

    本文研究了前述幾種結(jié)構(gòu)光空間頻率和相位估算算法在低調(diào)制度下的性能,分析發(fā)現(xiàn)SCC 算法能有效保證參數(shù)的估算精度,在不同調(diào)制度下具有較為廣泛的適應(yīng)性.之后進(jìn)一步研究了SCC 算法,對其進(jìn)行了簡化.原始的SCC 算法對同一個重疊區(qū)域的相關(guān)值進(jìn)行兩次迭代來分別測定空間頻率和相位,本文簡化后的SCC 算法能夠同時測定空間頻率和相位.通過模擬仿真驗(yàn)證簡化SCC 算法在低調(diào)制度下的性能,相比于其他算法,該算法可以更精確地測定空間頻率和相位.實(shí)驗(yàn)上,利用自建SIM 系統(tǒng)對牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine pulmonary artery endothelial cells,BPAE)成像,使用簡化SCC 算法測定了結(jié)構(gòu)光的空間頻率和相位,以此為基礎(chǔ)重建的圖像更為清晰,有效抑制了重建圖像的偽影.

    1 SIM的成像原理

    在SIM 中,通常使用余弦形式的結(jié)構(gòu)光照明樣本,余弦結(jié)構(gòu)光可以表示為

    式中:r 為空間坐標(biāo);pd、φ、I0、m 分別為結(jié)構(gòu)光的空間頻率、初始相位、平均強(qiáng)度和調(diào)制度;下標(biāo)d 表示結(jié)構(gòu)光條紋的方向.

    SIM 系統(tǒng)觀測到的樣本圖像可以表示為

    樣本的熒光分子濃度 C ( r )與結(jié)構(gòu)光Id,φ( r )的乘積,再卷積光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF) H ( r ),即為SIM 原始圖像Ed,φ(r).原理如圖1 所示,所得到的SIM 原始圖像如圖1(b)、(c)、(d)所示.

    對式(2)執(zhí)行傅里葉變換,可以得到SIM 原始圖像的頻譜表達(dá)式為

    在求解出低頻和高頻分量之后,需要對頻譜分量進(jìn)行維納濾波[14],即

    式中:上標(biāo)* 代表復(fù)共軛;Ψ0,d、Ψa,d和Ψb,d是的平均噪聲功率,通過和位于OTF 截止頻率外頻譜幅度的平方均值來估算[14];α和β為常數(shù),使用迭代非線性回歸的方法計(jì)算[15].濾波后的頻譜分量如圖1(e)、(g)、(i)所示.

    圖1 SIM原理示意Fig.1 Schematic diagram of structured illumination microscopy(SIM)

    濾波后再對高頻分量進(jìn)行移位,使用傅里葉移位定理將高頻分量移回到原來的空間位置[14].如圖1(f)、(h)、(j)所示.移位之后,根據(jù)式(7)將所有的頻譜分量通過廣義維納濾波進(jìn)行疊加,得到擴(kuò)展的超分辨圖像頻譜,如圖1(k)所示.

    式中:A ( k) 為切趾函數(shù);w 為維納濾波常數(shù).通過對執(zhí)行傅里葉逆變換可獲得重建的超分辨圖像.

    2 空間頻率和相位測定算法原理

    Lal 等[14]提出了IAC 和ISC 算法分別測定結(jié)構(gòu)光的空間頻率和相位.IAC 算法原理為

    ISC 算法的原理為

    式中 I1(r)=-cos(2πpdr+φ0),φ0是一個估計(jì)的初始相位.通過迭代變換相位 φ0,并根據(jù)式(10)計(jì)算 I1( r)與SIM 原始圖像Ed,φ(r)的相關(guān)值,直到迭代求出最大的相關(guān)值Cφ,此時的相位 φ0認(rèn)為是準(zhǔn)確值.但是,如果結(jié)構(gòu)光調(diào)制度較低,很難將余弦函數(shù) I1( r )與Ed,φ(r)上的結(jié)構(gòu)光條紋進(jìn)行準(zhǔn)確匹配,從而產(chǎn)生誤差.

    Shroff 等[15]提出 POP 算法測定結(jié)構(gòu)光的相位.根據(jù)式(3),當(dāng)k = pd時,式(3)變?yōu)?/p>

    當(dāng)SIM 原始圖像的信噪比較高,結(jié)構(gòu)光的調(diào)制度較高,空間頻率適中且物頻譜的高頻信息衰減得足夠快時,式(11)可以近似為

    Wicker[16]也提出AC 算法測定結(jié)構(gòu)光的相位.AC 算法的原理與IAC 算法和POP 算法原理較為相似.首先根據(jù)式(9)計(jì)算出自相關(guān)值Ck,然后根據(jù)POP 算法的近似條件對 Ck進(jìn)行近似處理,可以計(jì)算出結(jié)構(gòu)光的相位為

    對于AC 與POP 算法,當(dāng)結(jié)構(gòu)光調(diào)制度較低時,無法很好地滿足近似條件,此時計(jì)算結(jié)果存在誤差.

    3 簡化頻譜分量互相關(guān)算法

    式中c 為白噪聲的標(biāo)準(zhǔn)偏差.算法的思路如下:如果已知準(zhǔn)確的空間頻率和相位,那么就可以準(zhǔn)確地分離出低頻分量和高頻分量,并能將高頻分量移動到正確的空間位置上,由于重疊區(qū)域頻譜信息的相似性,其互相關(guān)值較高;如果空間頻率和相位不準(zhǔn)確,那么低頻與高頻分量就無法準(zhǔn)確地分離,高頻分量也無法準(zhǔn)確地移動,此時重疊區(qū)域的互相關(guān)值較低.可以利用這種性質(zhì),迭代計(jì)算出空間頻率和相位.

    Gustafsson 等[18]提出的SCC 算法通過迭代優(yōu)化重疊區(qū)域的相關(guān)值來計(jì)算空間頻率,而Wicker 等[17]使用的SCC 算法也是優(yōu)化同樣的重疊區(qū)域計(jì)算相位.本文的研究發(fā)現(xiàn),兩者是通過優(yōu)化相同的重疊區(qū)域來計(jì)算不同的參數(shù).因此,SCC 算法可以簡化合并,使其能夠同時計(jì)算空間頻率和相位.

    簡化后SCC 算法流程如圖2 所示.首先,設(shè)定空間頻率的迭代初始值pd和相位初始值1φ 、2φ 、3φ .然后,根據(jù)式(4)分別求出低頻分量和高頻分量,并利用傅里葉移位定理將高頻分量進(jìn)行移位.接下來根據(jù)式(14)計(jì)算重疊區(qū)域的互相關(guān)值.之后將計(jì)算出的相關(guān)值取負(fù),將相關(guān)值和迭代的初始點(diǎn)代入Matlab 函數(shù)fminsearch 中,對空間頻率和相位進(jìn)行迭代優(yōu)化[21],當(dāng)-為極小值時,所對應(yīng)的空間頻率和相位就是準(zhǔn)確值.該過程可用式(16)表示.函數(shù)fminsearch 的搜索原理是基于Nelder-Mead 的單純形算法,其具體原理可參考文獻(xiàn)[21].

    圖2 簡化SCC算法流程Fig.2 Flow chart of simplified spectral-component crosscorrelation(SCC) algorithm

    圖1(k)中包括兩個重疊的區(qū)域,但是這兩個重疊的區(qū)域所包含的信息在數(shù)學(xué)上是相同的,所以只需要計(jì)算任意一個重疊區(qū)域的互相關(guān)值即可.關(guān)于迭代初始點(diǎn)的選擇,可以將實(shí)驗(yàn)中直接測定的空間頻率和相位值作為迭代的初始點(diǎn).上述是0°方向結(jié)構(gòu)光條紋的空間頻率和相位的計(jì)算方法,其他條紋方向的計(jì)算方法與之相同.

    簡化的SCC 算法是一種迭代的算法,不存在近似的過程,所以理論上迭代出的空間頻率和相位值即為準(zhǔn)確值.而且簡化SCC 算法是對分離后的頻譜分量的重疊區(qū)域計(jì)算相關(guān)值,相比于IAC 算法,其避免了其他頻譜分量對相關(guān)值產(chǎn)生影響,所以在低調(diào)制度下也能保持準(zhǔn)確的結(jié)果.

    在測定出結(jié)構(gòu)光的空間頻率和相位之后,還可以利用重疊區(qū)域內(nèi)的頻譜信息來測定結(jié)構(gòu)光的調(diào)制度m[20],其計(jì)算式為

    4 仿 真

    通過仿真對算法進(jìn)行驗(yàn)證.仿真條件如下:結(jié)構(gòu)光的空間頻率為(165 nm)-1,樣本空間的像素尺寸設(shè)定為30 nm,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長512 nm,物鏡的數(shù)值孔徑為1.49,結(jié)構(gòu)光條紋的方向分別為0°、60°和120°,結(jié)構(gòu)光的理想相位分別為0、2 π /3和4 π /3,并且給相位引入了一個隨機(jī)的誤差.

    在不同的結(jié)構(gòu)光調(diào)制度下,模擬不同的空間頻率和相位測定算法的計(jì)算結(jié)果.結(jié)構(gòu)光調(diào)制度的范圍設(shè)定為0.01~1.00.為了分析噪聲的影響,給SIM 的原始圖像添加高斯噪聲和泊松噪聲.高斯噪聲的方差為0.001.對于泊松噪聲,使圖像中最亮的像素總計(jì)為1 000 個預(yù)期的光子,作為所有單個SIM 原始圖像的總和.在空間頻率的估算仿真上,將簡化的SCC算法與IAC 算法的結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果如圖3 所示.

    由于結(jié)構(gòu)光的空間頻率為矢量,通過分別計(jì)算空間頻率的長度誤差和方向誤差來表征空間頻率誤差.對于簡化的SCC 算法,在所討論的調(diào)制度范圍內(nèi)空間頻率的長度誤差均低于0.065%,空間頻率的方向誤差低于0.02°.而對于IAC 算法,當(dāng)調(diào)制度為0.18 時,空間頻率的長度誤差分別為0.64%(無噪聲)、1.37%(泊松噪聲)和1.82%(高斯噪聲).空間頻率的相位誤差分別為0.024 5°(無噪聲)、0.072 7°(泊松噪聲)和0.226 3°(高斯噪聲).當(dāng)調(diào)制度低于0.18時,IAC 算法的空間頻率誤差還會繼續(xù)增大.當(dāng)調(diào)制度大于0.18 時,這兩種算法的空間頻率誤差都很小.所以,簡化的SCC 算法在低調(diào)制度下有更準(zhǔn)確的計(jì)算結(jié)果.

    在相位的估算上,將簡化的SCC 算法、AC 算法和ISC 算法的相位誤差進(jìn)行比較,仿真結(jié)果如圖4所示.簡化后的SCC 算法可以同時計(jì)算結(jié)構(gòu)光的空間頻率和相位.但是AC 算法和ISC 算法需要提前知道空間頻率才能夠計(jì)算相位.在后面的討論中,AC算法和ISC 算法使用IAC 算法所計(jì)算出來的空間頻率去計(jì)算相位.

    在圖4 中,簡化的SCC 算法在無噪聲且調(diào)制度低于0.03 時相位誤差低于5°,當(dāng)調(diào)制度大于0.03時,相位誤差低于2.5°.如果存在泊松噪聲,該算法在調(diào)制度低于0.04 時相位誤差接近5°,當(dāng)調(diào)制度大于0.04 時,相位誤差稍大于2.5°.假設(shè)存在高斯噪聲,在調(diào)制度低于0.07 時,該算法的相位誤差大于5°,當(dāng)調(diào)制度大于0.07 時,其相位誤差低于5°,并隨著調(diào)制度增大而逐漸減小.對于AC 算法和ISC 算法,當(dāng)調(diào)制度低于0.18 時,由于IAC 算法存在誤差,因此AC 和ISC 算法也受其影響存在較大的誤差.當(dāng)調(diào)制度大于0.18 時,雖然IAC 算法的空間頻率誤差已經(jīng)很小,但是受到噪聲和調(diào)制度的影響,AC 算法和ISC 算法的相位誤差仍然大于簡化SCC 算法.所以,在整個調(diào)制度范圍內(nèi),簡化SCC 算法的相位誤差更小.

    為了獲得較高的分辨率,結(jié)構(gòu)光的空間頻率設(shè)定約為96.7%的OTF 截止頻率.有學(xué)者證明,當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率很高時,POP 算法會失效[17].因此,文中沒有討論P(yáng)OP 算法的相位誤差.

    圖3 在不同的調(diào)制度和噪聲水平下,簡化SCC算法與IAC算法的空間頻率長度與方向誤差Fig.3 Simulation of the magnitude and direction errors of the spatial frequencies of simplified spectral-component crosscorrelation(SCC)and IAC algorithms at different modulation depths and SNRs

    在使用不同的算法計(jì)算出空間頻率和相位后,利用所計(jì)算出的空間頻率和相位值來重建超分辨圖像,結(jié)果如圖5 所示.圖5(a)是仿真時使用的樣本圖像,圖5(b)是反卷積寬場圖像,圖5(c)~(k)是使用了不同的空間頻率和相位測定算法并結(jié)合式(4)~(8)在不同的調(diào)制度下所重建的圖像.可以看到,當(dāng)調(diào)制度為0.12 時,使用IAC、ISC 算法(圖5(f))和IAC、AC算法(圖5(i))重建的圖像存在很大的誤差,而簡化的SCC 算法可以成功地重建超分辨圖像(圖5(c)).當(dāng)調(diào)制度為0.18 時,使用簡化SCC 算法重建的圖像(圖5(d))比使用IAC、ISC 算法和IAC、AC 算法(圖5(g)和圖5(j))重建的圖像質(zhì)量更好.當(dāng)調(diào)制度為0.80 時,上述算法均能獲得良好的重建效果.

    為了定量地比較使用不同的算法在不同的調(diào)制度下所重建的圖像的質(zhì)量,對重建圖像的峰值信噪比(peak-signal-to-noise ratio,PSNR)進(jìn)行計(jì)算.計(jì)算結(jié)果如表1 所示.

    圖4 在不同的調(diào)制度和噪聲水平下,簡化SCC 算法、AC算法和ISC算法的相位誤差Fig. 4 Phase errors of the simplified spectral-component cross-correlation(SCC),AC,and ISC algorithms at different modulation depths and SNRs

    表1 重建圖像的峰值信噪比Tab.1 PSNRs of the reconstructed images

    PSNR 的值越大,說明重建圖像的質(zhì)量越好.首先分析結(jié)構(gòu)光調(diào)制度對重建圖像質(zhì)量的影響.當(dāng)結(jié)構(gòu)光調(diào)制度為0.80 時,無論使用哪種算法,其重建圖像的PSNR 均最大.所以隨著結(jié)構(gòu)光調(diào)制度的增加,重建圖像的質(zhì)量也逐漸提升.對于不同的算法而言,在不同的結(jié)構(gòu)光調(diào)制度下,簡化SCC 算法重建的圖像PSNR 比其他算法重建的圖像PSNR 更大,這說明簡化SCC 算法重建的圖像的質(zhì)量更好.所以由表1 可知,無論結(jié)構(gòu)光調(diào)制度高或低,使用簡化的SCC 算法所計(jì)算的結(jié)構(gòu)光空間頻率和相位所重建的圖像質(zhì)量均優(yōu)于以其他算法為基礎(chǔ)的重建圖像.

    圖5 圖像重建仿真Fig.5 Simulations of reconstructed images

    5 實(shí) 驗(yàn)

    在自建的 SIM 系統(tǒng)上對牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine pulmonary artery endothelial cells,BPAE)成像,檢驗(yàn)簡化SCC 算法在超分辨圖像重建上的效果.SIM 系統(tǒng)所使用的物鏡是 Nikon CFI APOTRIF 100XH,數(shù)值孔徑1.49.顯微鏡主體的中間放大倍率為1.5 倍,總的放大倍率為150 倍.顯微鏡的探測器是靈敏的sCOMS(Andor Zyla 4.2 Plus),像素尺寸為6.5 μm. 樣品是三色染色的 BPAE 細(xì)胞,用MitoTracker?Red CMXRos 標(biāo)記線粒體,藍(lán)色熒光DNA 染料DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核,Alexa Fluor 488 鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動蛋白.激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長512 nm.結(jié)構(gòu)光的調(diào)制度約為0.17.在重建圖像之前,需要對原始圖像進(jìn)行預(yù)處理.首先,通過Matlab函數(shù) adapthisteq 來提高原始圖像的局部對比度.然后,選擇其中一張?jiān)紙D像作為參考基準(zhǔn),調(diào)整其他原始圖像的強(qiáng)度直方圖與參考圖像的直方圖匹配,可使用Matlab 函數(shù)imhistmatch 來進(jìn)行[12].

    用不同算法計(jì)算出的空間頻率和相位所重建的圖像如圖6 所示.在結(jié)構(gòu)光調(diào)制度為0.17 時,使用簡化SCC 算法所計(jì)算出的空間頻率和相位重建的圖像(圖6(b))明顯優(yōu)于以其他算法為前提的重建圖像(圖6(c)和(d)).與反卷積后的寬場圖像(圖6(a))相比,圖6(b)中重建圖像呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)更為精細(xì),如白色箭頭標(biāo)注的位置能清晰展現(xiàn)3 個分支,而反卷積寬場圖像則無法分辨.此處的歸一化強(qiáng)度曲線如圖6(e)所示,重建圖像的分辨率明顯提升.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,簡化SCC 算法在低調(diào)制度下有助于更清晰地重建超分辨圖像.

    圖6 實(shí)驗(yàn)圖像重建結(jié)果比較Fig.6 Comparison of the experimentally reconstructed images

    6 結(jié) 語

    本文研究了結(jié)構(gòu)光在低調(diào)制度下空間頻率和相位的測定算法,通過對多種算法的分析和對比發(fā)現(xiàn)SCC 算法能在不同調(diào)制度下具有更廣泛的適應(yīng)性,精確地測算相關(guān)參數(shù).文中對SCC 算法做了進(jìn)一步研究,通過合并空間頻率和相位的迭代過程實(shí)現(xiàn)了SCC 算法的簡化,簡化后的SCC 算法可以同時精確地測定空間頻率和相位.仿真結(jié)果表明,該算法在結(jié)構(gòu)光調(diào)制度較低時仍能準(zhǔn)確地計(jì)算參數(shù),相比于其他算法,其空間頻率和相位誤差更小.在自建的SIM 系統(tǒng)中對BPAE 細(xì)胞樣本成像,在低調(diào)制度下,用簡化的SCC 算法測定空間頻率和相位,更為清晰地重建了BPAE 細(xì)胞圖像,分辨率明顯提升,并抑制了重建圖像的偽影.簡化的SCC 算法能適應(yīng)不同SIM 系統(tǒng)對結(jié)構(gòu)光空間頻率和相位精確測定的需求,也能提高SIM 系統(tǒng)的魯棒性.

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