某鴨場多種病原混合感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

吳冬梅，金 鴻，張 霞，張人俊，劉妍罕，曾茂芹，文 明，胡安東*

(1.凱里市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 凱里 556000；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

大力發(fā)展養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)是黔東南苗族侗族自治州實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要措施之一。2021年3月，某養(yǎng)鴨場從廣西引進(jìn)1日齡鴨苗3 000羽，21日齡時(shí)鴨群出現(xiàn)零星死亡病例，病鴨死亡前精神沉郁，呼吸困難，排白色或綠色稀糞，偶有淡黃色稀糞，至35日齡時(shí)死亡300余只。經(jīng)調(diào)查，鴨群已免疫禽流感疫苗和鴨肝炎疫苗，病鴨曾用硫酸粘桿菌素、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素和磺胺藥物進(jìn)行治療，但效果不明顯。為查明鴨群發(fā)病死亡的原因，選取5只瀕死病鴨送至貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，現(xiàn)將診斷情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集解剖5只瀕死病鴨，分別無菌采集肝臟和脾臟混合樣品5份，同時(shí)觀察瀕死鴨各組織器官的病理變化。

1.2 主要試劑和儀器(1)試劑：鮮血瓊脂培養(yǎng)基(貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所提供)；葡萄糖、乳糖、麥芽糖等16種生化鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)；DNA/RNA提取試劑盒、DL 500 DNA Marker、DNA聚合酶等PCR檢測試劑[天根生化科技(北京)有限公司]。(2)儀器：LS50HJ型立式蒸汽滅菌器(江陰市濱江醫(yī)療設(shè)備公司)、D3024R型高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼公司)、MyCycler型PCR儀(美國Bio-Rad公司)、GenoSens 1800型凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智科技公司)。

1.3 PCR引物由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所提供相關(guān)病毒PCR檢測引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.4 細(xì)菌分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌取鴨肝臟深部組織接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

1.4.2 細(xì)菌生化鑒定挑取單個(gè)菌落接種于鮮血瓊脂斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取純培養(yǎng)菌落接種于細(xì)菌生化鑒定管，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。需鑒別血清型的細(xì)菌則取其培養(yǎng)物送四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心進(jìn)行血清型鑒定。

1.5 病毒核酸檢測分別取5份瀕死病鴨肝臟和脾臟混合樣品，勻漿后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，用DNA提取試劑盒提取各樣品總DNA，分別用鴨腸炎病毒和鴨圓環(huán)病毒特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；另取離心上清液100 μL，用RNA提取試劑盒提取各樣品總RNA，分別用鴨肝炎病毒和新城疫病毒特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。取各擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病理變化由圖1可見：病鴨主要病理變化為心包纖維素性炎癥(3/5)，心包積液(2/5)，脾臟腫大、質(zhì)脆(3/5)，盲腸臌氣(2/5)。

A：心包纖維素性炎癥；B：心包積液；C：脾臟腫大、質(zhì)脆；D：盲腸臌氣圖1 病理變化

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)、染色鏡檢5份病死鴨肝臟樣品在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出2種優(yōu)勢菌落：1種是邊緣整齊、有光澤、透明、不溶血的白色小菌落，革蘭氏染色鏡檢為單個(gè)或成雙排列、兩極著色的革蘭氏陰性短小桿菌(見圖2A)；另1種是中等大小、圓形、光滑、不溶血的白色或黃色菌落，革蘭氏染色鏡檢為散在或葡萄串狀排列的革蘭氏陽性球菌(見圖2B)。

A：革蘭氏陰性桿菌；B：革蘭氏陽性球菌圖2 分離細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢(×100)

2.2.2 細(xì)菌生化鑒定(1)取革蘭氏陰性菌培養(yǎng)物接種生化鑒定管，結(jié)果：該菌能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、蔗糖、甘露醇；不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，不利用枸櫞酸鹽；M.R、V-P試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性；氧化酶、過氧化氫酶試驗(yàn)陽性。符合鴨疫里默氏桿菌的生化特征，初步判定為鴨疫里默氏桿菌。經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心血清型鑒定，結(jié)果為鴨疫里默氏桿菌血清2型。(2)取革蘭氏陽性球菌培養(yǎng)物接種生化鑒定管，結(jié)果：該菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不分解阿拉伯糖和纖維二糖；能還原硝酸鹽和液化明膠；不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，V-P試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)陽性；氧化酶試驗(yàn)陰性。符合金黃色葡萄球菌的生化特性，結(jié)合菌落特征和菌體形態(tài)特點(diǎn)，判定為金黃色葡萄球菌。

2.3 病毒核酸檢測結(jié)果由圖3可見：在5份肝脾混合樣品中，1、3號樣品檢出鴨腸炎病毒特異性DNA條帶(見圖3A)，1、2、3、5號樣品檢出鴨圓環(huán)病毒特異性DNA條帶(見圖3B)，表明送檢鴨病料組織中存在鴨腸炎病毒和鴨圓環(huán)病毒感染。未檢出鴨肝炎病毒和新城疫病毒。

A：鴨腸炎病毒；B：鴨圓環(huán)病毒M：DL 500 Marker；+：陽性對照；-：陰性對照；1～5：檢測樣品圖3 病毒PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定和病毒核酸檢測，結(jié)合臨床癥狀、病理變化，確診病例存在鴨疫里默氏桿菌、金黃色葡萄球菌、鴨腸炎病毒、鴨圓環(huán)病毒混合感染。

4 討論

在養(yǎng)鴨過程中，導(dǎo)致雛鴨感染發(fā)病死亡的病原體較多，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲。鴨腸炎病毒亦稱鴨瘟病毒，主要侵害30日齡以上的鴨，引起鴨下痢，但近年來鴨腸炎病毒呈現(xiàn)感染日齡不斷提前的趨勢[1]。鴨圓環(huán)病毒對各種日齡鴨均可感染，單純感染僅引起鴨發(fā)育不良、生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率低等現(xiàn)象，但對鴨造成免疫抑制，易導(dǎo)致鴨感染其他病原體，增加感染鴨的發(fā)病率和死亡率[2]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，通常新城疫病毒對水禽不易致病，感染鴨一般不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但近年來新城疫病毒感染鴨的病例較多，并發(fā)現(xiàn)新城疫病毒可侵害雛鴨的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，引起呼吸困難、腹瀉、神經(jīng)癥狀等，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。本次送檢病例通過細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定和病毒核酸檢測，存在鴨疫里默氏桿菌、金黃色葡萄球菌、鴨腸炎病毒、鴨圓環(huán)病毒混合感染。建議及時(shí)隔離或淘汰病鴨，加強(qiáng)養(yǎng)殖場環(huán)境消毒，同時(shí)做好健康鴨群的鴨病毒性腸炎疫苗接種，采用敏感抗生素控制細(xì)菌感染。