低DCAD對經(jīng)EDTA誘導(dǎo)的低血鈣山羊的鈣調(diào)因子水平及瘤胃發(fā)酵的影響

■馬政發(fā) 楊春紅 許 可 吳文旋,2* 吳佳海

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州省山地畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)工程實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550006）

低血鈣癥臨床表現(xiàn)為血鈣濃度低于8 mg/dL，是常發(fā)生在圍產(chǎn)期乳畜的營養(yǎng)代謝性疾病，低血鈣容易誘發(fā)酮病、乳房炎、產(chǎn)后癱瘓等多種疾病，影響圍產(chǎn)乳畜的生長健康和生產(chǎn)性能。實際生產(chǎn)中防治低血鈣的方法，如圍產(chǎn)前期補充維生素D 和甲狀旁腺激素、產(chǎn)犢時使用CaCl2等補鈣制劑或產(chǎn)前飼喂低鈣飼糧等，存在諸多困難而不再使用。飼糧陰陽離子差（di?etary cation-anion difference, DCAD）具有操作簡單和實用性強的優(yōu)點，是當(dāng)前生產(chǎn)中防治低血鈣最有效的措施。DCAD 是指每千克飼糧干物質(zhì)中主要陽離子（Na+、K+）和陰離子（Cl-、S2-）之間毫摩爾數(shù)的差值，低DCAD 可誘導(dǎo)機體酸化產(chǎn)生酸中毒，促進骨鈣動員、小腸鈣吸收以及腎鈣重吸收，有效維持體內(nèi)血鈣穩(wěn)恒，提高血鈣濃度。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）是一種絡(luò)合劑，能與Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+等金屬離子結(jié)合而消除相應(yīng)離子的功效。EDTA 可被研究用于礦物質(zhì)代謝來誘導(dǎo)低血鈣狀態(tài)，從而建立試驗動物生理和體液的生物模型。研究指出，通過靜脈注射Na2EDTA 可成功誘發(fā)低血鈣。以上研究為將EDTA 和低DCAD 聯(lián)合使用提高血鈣水平防治低血鈣提供了有益的借鑒，但目前鮮見相關(guān)研究報道。據(jù)此，本試驗通過在飼糧中添加EDTA人工降低血鈣含量建立低血鈣模型后，再飼喂低DCAD 飼糧，研究血鈣水平恢復(fù)、鈣調(diào)蛋白因子以及瘤胃發(fā)酵參數(shù)的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選用年齡（2.5±0.2）年、體重（43.6±2.2）kg差異不顯著的6 只黔北麻羊母羊（貴州地方品種山羊）為試驗動物，隨機分為兩組：對照組和處理組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)1只羊，開展三個階段的試驗，每個階段持續(xù)20 d。第一階段為適應(yīng)期，用于觀察試羊健康狀況，更換籠位、驅(qū)蟲、消毒管理并觀察試羊?qū)︼暭Z的適應(yīng)性。第二階段為EDTA處理期，在試羊飼糧中添加2%的EDTA誘發(fā)低血鈣。第三階段為DCAD處理期，分別飼喂對照組（DCAD=203 mmol/kg DM）和處理組（DCAD=-170 mmol/kg DM）飼糧，然后采樣。其中處理組飼糧在對照組的基礎(chǔ)上添加45 g/d 的陰離子鹽（MgSO4·7H2O+MgCl2·6H2O），3 個階段試驗羊飼糧結(jié)構(gòu)一致，其飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 山羊飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗羊單籠舍飼，試驗開始前驅(qū)蟲，每天8：00、12：00、18：00飼喂3次，保證試羊自由采食、自由飲水。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 采食量

連續(xù)測定試驗最后5 d 采食量。測定方法為：晨飼前清理食槽，準(zhǔn)確記錄飼喂量和次日剩料量，計算干物質(zhì)采食量（DMI）。

1.3.2 尿液pH

自第三階段開始，每天在試驗羊采食2 h 后測定尿液pH，判斷低DCAD 飼糧是否引起山羊體內(nèi)酸化。檢測方法：使用pH精密試紙（pH范圍為5.4～7.0，6.4～8.0，上海試劑三廠）蘸取試驗羊所排的新鮮尿液，在試紙顯示顏色3 s后與精密比色卡比對觀察。

1.3.3 血鈣水平

血樣采集分3步進行，用抗凝血管經(jīng)頸靜脈采血10 mL，4 000 r/min 離心15 min（80-2 型離心沉淀機；江蘇中大儀器科技有限公司），收集血漿，用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定血漿中Ca2+水平。采樣方法為，在第一階段，連續(xù)3 d 采血檢測，確保血漿Ca2+水平均處于正常范圍內(nèi)（8～12 mg/dL）；在第二階段，EDTA 處理后，每3 d采血測定使其處于下降狀態(tài)，直至發(fā)生低血鈣（＜8 mg/dL）；在第三階段，DCAD 處理后，每3 d 采血測定，直至血漿Ca2+含量最終正常。

1.3.4 血鈣代謝因子

在第三階段最后1 d，用抗凝血管經(jīng)頸靜脈采血10 mL，在4 000 r/min 條件下離心15 min（80-2 型離心沉淀機；江蘇中大儀器科技有限公司），收集血漿，用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定血漿中甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）、瞬時受體電位通道香草酸受體6（transient receptor potential vanilloid receptor 6, TRPV6）、維生素D 受體（vitamin D receptor, VDR）、鈉鈣交換體1（Na+/Ca2+exchanger 1, NCX1）、細(xì)胞膜鈣泵（plasma membrane Ca-ATPase 1b, PMCA1b）水平。

1.3.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

第三階段試驗結(jié)束后，在晨飼前用瘤胃液采集器經(jīng)口腔插入采集山羊的瘤胃液，測定瘤胃pH（FG2-ELK，梅特勒-托利多儀器），4 層紗布過濾后離心20 min（12 000 r/min），取上清液測定氨態(tài)氮（ammonia nitrogen, NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）。其中NH3-N 濃度參照王加啟的方法測定；VFA 參照尹召華等的方法測定，利用氣相色譜儀（GC-9A，日本島津）進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件中獨立樣本t檢驗進行分析，試驗結(jié)果以“平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示，P＜0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低DCAD飼糧對山羊DMI的影響（見表2）

表2 低DCAD飼糧對山羊DMI的影響

由表2 可知，處理組DMI 略低于對照組，兩組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 低DCAD飼糧對山羊尿液pH的影響（見表3）

表3 低DCAD飼糧對山羊尿液pH的影響

在第三階段，對照組山羊尿液pH 在整個試驗期均保持穩(wěn)定，處于7.7～8.0 之間（pH=7.9±0.1）；處理組山羊采食低DCAD 水平飼糧后尿液pH 值下降（pH=6.5±0.7），顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.3 低DCAD 飼糧對山羊血漿鈣及鈣調(diào)節(jié)因子的影響（見表4）

表4 低DCAD飼糧對山羊血漿鈣及鈣調(diào)節(jié)因子的影響

由表4 可見，在第三階段處理組血漿Ca2+、VDR、TRPV6 和PMCA1b 顯著高于對照組（P＜0.05）。處理組PTH、NCX1 水平均略高于對照組，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 低DCAD飼糧對山羊瘤胃發(fā)酵的影響（見表5）

表5 低DCAD飼糧對山羊瘤胃發(fā)酵的影響

由表5 可知，與對照組相比，處理組丙酸濃度顯著升高（P＜0.05）。兩組其余指標(biāo)（瘤胃pH、NH3-N 濃度、TVFA）差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 低DCAD飼糧對山羊干物質(zhì)采食量的影響

干物質(zhì)采食量（DMI）反映飼料適口性的好與壞，影響著動物的生長、泌乳及繁殖性能，許多研究均表明低DCAD 飼糧會引起動物DMI 下降。一方面是由于降低DCAD 水平所添加的陰離子鹽帶有苦澀味，會影響飼糧適口性，DMI 也隨之降低。另一方面是因為低DCAD 會引起血液酸堿度和碳酸氫鹽水平降低，減弱瘤胃的緩沖能力；同時胃腸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感覺神經(jīng)元中酸敏感離子通道可能會感應(yīng)到低DCAD 的質(zhì)子負(fù)荷變化，從而改變神經(jīng)元的興奮性狀態(tài)，共同影響著動物的采食行為與食欲。本試驗在DCAD 處理期開始時，也觀察到DMI 下降的現(xiàn)象，但隨著飼喂時間的延長，處理組山羊逐漸恢復(fù)正常采食，表明飼喂低DCAD 飼糧所導(dǎo)致的機體酸堿平衡狀態(tài)改變并不是影響山羊DMI 的最主要因素，這得到朱倫琴等、于磊等研究結(jié)果的支持。同時本試驗所飼喂的飼糧為顆粒飼料，一定程度上掩蓋了陰離子鹽的苦澀味，提高了飼糧的可食用性。結(jié)合前期研究結(jié)果，說明飼喂顆粒化飼糧可改善陰離子鹽的適口性來防止DMI 的下降。

3.2 低DCAD飼糧對山羊尿液pH的影響

尿液pH 是評估陰離子鹽飼糧引起機體代謝性酸中毒程度的關(guān)鍵指標(biāo)，其變化范圍可以衡量血鈣水平的恒穩(wěn)狀態(tài)，常用來反映飼糧的DCAD 水平是否適宜。尿液pH 的改變是由于機體攝入陰離子Cl-、S2-后，導(dǎo)致Cl-、S2-在血液中的水平升高，為維持溶液的電中性，機體則通過增加尿液中的H+來排泄出多余的Cl-、S2-，最終尿液pH 呈現(xiàn)出降低的現(xiàn)象。一般而言，尿液pH 維持在5.5～6.8 比較合適，當(dāng)尿液pH 低于5.5 時會引起機體過度酸化以及代謝性酸中毒作用的問題，對動物造成損傷的同時并沒有額外的收益；然而當(dāng)尿液pH 大于6.8時機體的酸化并不充分，PTH 對鈣調(diào)因子的作用較弱，對改善血鈣穩(wěn)衡以及防治低血鈣意義不大。本試驗的尿液pH 受DCAD 的改變而下降，但仍處于合理范圍之內(nèi)（pH=6.5±0.7），充分表明DCAD 與尿液pH 之間存在很強的關(guān)聯(lián)性，與相關(guān)研究結(jié)論類似。

3.3 低DCAD 飼糧對山羊血鈣及其相關(guān)代謝指標(biāo)的影響

鈣是動物必需的重要元素，參與神經(jīng)元活動、調(diào)節(jié)酶活、血液凝集、激素合成分泌等機體各種生理代謝過程。機體可通過胃腸道對鈣吸收、骨鈣溶解和腎重吸收鈣來使血鈣水平維持在一定范圍內(nèi)，靜脈注射EDTA可以影響腸道和骨骼中鈣的吸收以及免疫抑制的變化，在誘導(dǎo)低血鈣癥上已有許多研究。與其他研究不同的是，本試驗采用直接飼喂EDTA的方式來與體內(nèi)的鈣絡(luò)合達到降低血鈣含量的目的，山羊血鈣水平在進入第三階段前已低于8 mg/dL，處于低血鈣狀態(tài)。此后飼喂對照組和處理組飼糧，處理組血鈣水平顯著高于對照組，結(jié)合處理組尿液pH 值顯著降低，說明含陰離子鹽的低DCAD 飼糧可誘發(fā)機體輕度代謝性酸中毒，促進飼料鈣在小腸的吸收，同時還可以促進骨鈣動員，進而加快血鈣水平的恢復(fù)速度。Goff等前期研究結(jié)果也表明，飼喂低DCAD 飼糧可提高血鈣水平。

骨鈣溶解需以胃腸道鈣吸收量不足為前提，才能釋放骨鈣進入血液，提高血鈣水平。由于尿鈣濃度很低，腎重吸收鈣對維持血鈣水平的貢獻十分有限，不是提高血鈣水平的主要因素。因此，增強胃腸道對鈣的吸收能力是實現(xiàn)血鈣水平提高的最佳方式。鈣在胃腸道的吸收包括細(xì)胞旁路被動擴散入血和跨上皮細(xì)胞刷狀緣部主動吸收兩種方式，其中以主動跨膜吸收為主。Ca2+跨膜途徑受多種因子的協(xié)同調(diào)控，吸收過程分3 步進行：①首先由位于細(xì)胞膜上對Ca2+有高度選擇性的特異轉(zhuǎn)運通道蛋白TRPV6 轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞；②在細(xì)胞內(nèi)與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運至細(xì)胞基膜；③跨細(xì)胞膜排出入血，這一步驟由PMCA1b 和NCX1 發(fā)揮作用。此外PTH 能促進機體合成與分泌Ca2+轉(zhuǎn)運介質(zhì)1，25-二羥維生素D3[1，25-（OH）2VD3]，VDR 則通過與1，25-（OH）2VD3結(jié)合促進胃腸道上皮細(xì)胞形成鈣結(jié)合蛋白，二者在Ca2+的吸收過程中也發(fā)揮著重要的作用。綜合來看，PTH、VDR、TRPV6、PMCA1b、NCX1 等因子水平是影響胃腸道鈣吸收效率的關(guān)鍵因素。前期報道發(fā)現(xiàn)，低DCAD 飼糧可提高PTH、TRPV6、VDR 的水平，這是因為低DCAD 破壞機體的酸堿平衡，代謝性酸中毒提高了組織對鈣調(diào)節(jié)激素的響應(yīng)能力，刺激甲狀旁腺主細(xì)胞對PTH 的分泌，1，25-（OH）2VD3的合成也隨之增加；同時它們的提高能激活磷脂肌醇信號系統(tǒng)（protein kinase system, PKC system）誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酸酶的釋放，進而刺激TRPV6 的生成。此外低DCAD 所誘導(dǎo)的酸化作用還會上調(diào)VDR mRNA 的表達，促進VDR 與1，25-（OH）2VD3相結(jié)合，增進鈣的吸收。本試驗與對照組相比，低DCAD飼糧組的PTH、VDR、TRPV6 都出現(xiàn)上升的趨勢，其中VDR、TRPV6 達到顯著差異水平，這與相關(guān)研究一致。在Ca2+吸收過程中，PMCA1b 依賴ATP 以電化學(xué)梯度的形式將Ca2+排出細(xì)胞外；而NCX1 轉(zhuǎn)運蛋白則依靠介導(dǎo)Na+內(nèi)流、Ca2+外排和作用相反的兩種轉(zhuǎn)運模式來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平。本試驗結(jié)果顯示，低DCAD 飼糧可提高PMCA1b 和NCX1 的水平，提高鈣的吸收效率。

綜上，飼喂低DCAD飼糧能提高血鈣水平的恢復(fù)速率，上調(diào)鈣調(diào)控因子水平，加強胃腸道吸收鈣入血過程的化學(xué)反應(yīng)。

3.4 低DCAD飼糧對山羊瘤胃發(fā)酵的影響

反芻動物的瘤胃pH、NH3-N 和VFA 是評價瘤胃發(fā)酵狀態(tài)和正常功能的首要指標(biāo)，反映出瘤胃微生物對飼料養(yǎng)分的消化吸收情況。瘤胃pH 的大小表明瘤胃是否處于健康狀態(tài)，與瘤胃微生物對纖維素的消化程度直接相關(guān)。莘海亮等通過對山羊飼喂不同DCAD 水平飼糧，發(fā)現(xiàn)低DCAD 飼糧組的瘤胃pH與高DCAD 飼糧組相比差異不顯著。這與本試驗結(jié)果類似，也得到其他報道的支持。以上研究充分說明了，飼喂含陰離子鹽飼糧并不會引起瘤胃酸堿度的明顯改變，不會對瘤胃pH 產(chǎn)生明顯影響。瘤胃內(nèi)含氮物的代謝主要是能利用飼料的蛋白質(zhì)和非蛋白氮，同時合成微生物蛋白供機體所用，常用瘤胃NH3-N 來衡量氮的代謝利用情況。Wang 等報道，DCAD 變化不會影響瘤胃pH、NH3-N 和TVFA 的摩爾百分比。本試驗結(jié)果也表明，處理組瘤胃NH3-N 水平與對照組相比也未產(chǎn)生顯著差異。TVFA 主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，是飼料碳水化合物（carbohy?drate, CHO）被瘤胃微生物降解的產(chǎn)物，在瘤胃壁吸收后氧化供能，主要受飼糧碳水化合物含量的影響。Nguyen 等最新研究表明，DCAD 水平變化不會影響奶山羊瘤胃TVFA、丙酸和乙酸/丙酸水平。本試驗結(jié)果顯示，處理組乙酸、丁酸、乙酸/丙酸、TVFA與對照組差異不顯著，但丙酸含量顯著高于對照組，其原因有待于進一步研究。

4 結(jié)論

山羊飼糧添加EDTA可降低血鈣水平，在此條件下飼喂低DCAD飼糧有利于血鈣水平的恢復(fù)，且并不會影響瘤胃發(fā)酵。但有關(guān)EDTA 降低血鈣的分子機制、低DCAD飼糧對胃腸道組織鈣調(diào)因子表達水平及信號通路的影響尚待進一步深入研究。