豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型、弓形蟲混合感染病例的病原學(xué)診斷

宋 春，陳 靜，2，成虹松，2，李 梅，2，李 濤，程振濤，2*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

2020年8月，貴州省龍里縣某豬場(chǎng)的育肥豬群發(fā)病，病初精神沉郁、食欲下降、被毛雜亂、呼吸困難，耳部、四肢皮膚輕微發(fā)紺，胸下及腹下皮膚出現(xiàn)紅斑，后陸續(xù)死亡。發(fā)病數(shù)198頭，發(fā)病率25%，死亡96頭，病死率48.5%。為確診病因，對(duì)5頭病死豬進(jìn)行解剖并采集病料組織，在流行病學(xué)調(diào)查及初步臨床診斷的基礎(chǔ)上開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷，為該養(yǎng)殖場(chǎng)疫病的準(zhǔn)確防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料無菌采集豬場(chǎng)5頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、肝臟組織樣品作為檢測(cè)病料。

1.2 主要試劑豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒(PRV)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(購自北京世紀(jì)元亨公司)；2×TaqPCR MastreMix(購自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker(購自大連寶生物工程有限公司)；鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(自制)。

1.3 主要儀器T20 型雙槽梯度 PCR 儀(購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、Tanon 1600型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(購自上海天能公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(購自常州金壇良友儀器有限公司)、CX33O型OLYMPUS 生物顯微鏡(購自上海普赫光電科技有限公司)。

1.4 引物參照 GenBank 數(shù)據(jù)庫豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF1基因序列(登錄號(hào)：KM191124.1)，應(yīng)用 Primer 5.0 軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(PCV2-F：5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’；PCV2-R：5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’)，引物Tm值56 ℃。參照 GenBank 數(shù)據(jù)庫弓形蟲(Toxophasma)RH株B1基因序列(登錄號(hào)：AF179871)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(T-F：5’-CGCTGCAGGGAAGACGAAAGT TG-3’；T-R：5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTG GAT-3’)，引物Tm值55 ℃。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定將5頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、肝臟組織樣品分別無菌劃線接種于鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。

1.6 組織樣品DNA、RNA的提取取5頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、肝臟組織各1 g，每頭豬組織樣品混合于滅菌研缽，加入適量 PBS液，充分研磨，8 000 r/min、25 ℃離心2 min，提取上清液100 μL，用DNA/RNA試劑盒于26 ℃室溫環(huán)境下分別提取5頭豬樣品的總DNA/RNA。

1.7 相關(guān)病原核酸檢測(cè)

1.7.1 PRRSV核酸檢測(cè)分別以提取的各組織樣品總RNA為模板，構(gòu)建qRT-PCR反應(yīng)體系25 μL：無菌無核酸酶水5 μL，qRT-PCR反應(yīng)液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，熒光探針4.5 μL，模板RNA 2 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。以Cq值≤35并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽性。

1.7.2 PRV核酸檢測(cè)分別以提取的各組織樣品總DNA為模板，構(gòu)建qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL ：無菌無核酸酶水5.9 μL，PCR反應(yīng)液10 μL，熒光探針 2.1 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min ；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，以Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽性。

1.7.3 PCV-2核酸檢測(cè)分別以提取的各組織樣品總DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行PCV-2核酸檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqMastreMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸 10 min。取PCR產(chǎn)物 8 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段353 bp)。

1.7.4 弓形蟲核酸檢測(cè)分別以提取的各組織樣品總DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行弓形蟲核酸檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqMastreMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段319 bp)。

M ：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；+：陽性對(duì)照；1～5：5頭豬組織樣品；-：陰性對(duì)照?qǐng)D4 弓形蟲 PCR檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定5頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、肝臟病料中均未分離培養(yǎng)出細(xì)菌，表明無細(xì)菌感染。

2.2 相關(guān)病原核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 PRRSV核酸檢測(cè)由圖1可見：陽性對(duì)照Cq值為29，3、4、5號(hào)豬檢測(cè)樣品中Cq值<35，表明3、4、5號(hào)豬組織樣品中存在PRRSV感染。1、2號(hào)豬檢測(cè)樣品Cq值均>35，說明1、2號(hào)豬組織樣品中不存在PRRSV感染。

+：陽性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；AS1～5：5頭豬組織樣品圖1 PRRSV qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 PRV核酸檢測(cè)由圖2可見：陽性對(duì)照Cq值為23.2，5頭豬檢測(cè)樣品Cq值均>30，說明組織樣品中均不存在PRV感染。

+：陽性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；AS1～5：5頭豬組織樣品圖2 PRV qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 PCV-2 核酸檢測(cè)由圖3可見：5頭豬檢測(cè)樣品均出現(xiàn)353 bp目的條帶，與陽性對(duì)照相符，表明5頭豬組織樣品均存在PCV-2感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；+：陽性對(duì)照；1～5：5頭豬組織樣品；-：陰性對(duì)照?qǐng)D3 PCV-2 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.4 弓形蟲核酸檢測(cè)由圖4可見：3、5號(hào)豬檢測(cè)樣品出現(xiàn)319 bp目的條帶，與陽性對(duì)照相符，表明3、5號(hào)豬組織樣品存在弓形蟲感染。1、2、4號(hào)豬檢測(cè)樣品未出現(xiàn)目的條帶，說明1、2、4號(hào)豬組織樣品中不存在弓形蟲感染。

3 結(jié)論

通過對(duì)5頭病死豬送檢組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定和相關(guān)病原核酸檢測(cè)，結(jié)果表明：該豬場(chǎng)病例存在PRRSV、PCV-2、弓形蟲混合感染。

4 討論

4.1豬感染PRRSV可引起嚴(yán)重的免疫抑制，繼發(fā)多種病原體感染，造成發(fā)病豬群的死亡率大幅升高[1]。感染妊娠母豬主要表現(xiàn)為呼吸困難、繁殖障礙；仔豬、保育豬主要表現(xiàn)為高熱、消瘦、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、耳部和體表皮膚發(fā)紫等癥狀(俗稱藍(lán)耳病)，發(fā)病率和死亡率高[2]。近年來高致病性PRRSV 變異株的出現(xiàn)進(jìn)一步加大了該病的防控難度，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。PVC主要有3種類型：PCV-1、PCV-2和近年來新發(fā)現(xiàn)的PCV-3。PCV-1不致病，PCV-2是當(dāng)前豬群中最主要的致病病毒之一，而PCV-3的致病性還有待進(jìn)一步研究[4,5]。PCV-2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎與腎病綜合征的主要病原，臨床癥狀以病豬漸進(jìn)性消瘦或生長遲緩、精神沉郁、呼吸困難、咳嗽為主要特征。PCV-2對(duì)豬群的危害主要是引起免疫抑制，使疫苗接種不能產(chǎn)生充分免疫應(yīng)答，易與其他病原混合感染[6,7]。弓形蟲是1種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，感染后病豬出現(xiàn)厭食、呼吸困難、肌肉無力、腹瀉等癥狀，造成病豬免疫力低下，死亡率可達(dá)60%，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。隨著集約化程度的提高和養(yǎng)殖密度的增大，養(yǎng)殖場(chǎng)多種病原混合感染現(xiàn)象比較常見，單純依靠養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)或臨床診斷往往不準(zhǔn)確，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[9]。

4.2近年來國內(nèi)外有關(guān)PRRSV與PCV-2混合感染報(bào)告較多，已引起廣泛關(guān)注。我國豬群中PRRSV 與PCV-2混合感染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，這2種病毒均可導(dǎo)致免疫抑制，相互促進(jìn)病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀和病理損傷[10]。本次檢測(cè)也證實(shí)該豬群存在較嚴(yán)重的PRRSV與PCV-2混合感染。此外，常見的混合感染還有PRRSV與PRV、豬細(xì)小病毒(PPV)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)等，但與弓形蟲的混合感染較少見。PCV-2的免疫抑制可能誘發(fā)弓形蟲病，而混合感染引起的免疫刺激可能導(dǎo)致PCV-2的廣泛復(fù)制[11]。弓形蟲病和藍(lán)耳病、鏈球菌病、豬肺疫、豬圓環(huán)病毒病等都表現(xiàn)出高熱、呼吸困難、肺臟出血等特征，臨床癥狀、剖檢病理變化等方面十分相似[2]。因此豬場(chǎng)出現(xiàn)疑似疫情時(shí)，應(yīng)及時(shí)請(qǐng)專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，明確病因，積極采取防治措施，減少發(fā)病和死亡。