丹酚酸A對干擾素γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的影響及其機(jī)制

王 靜，鄧慶華

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331)

特應(yīng)性皮炎是一種多功能、異質(zhì)性的慢性炎癥性皮膚病，因其遺傳和化學(xué)過敏原等多種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，其臨床表現(xiàn)各異[1]。常用的治療特應(yīng)性皮炎的藥物是抗炎皮質(zhì)類固醇。然而，這些類固醇的長期使用可引起皮膚萎縮和全身不良影響[2]。因此，需要開發(fā)副作用低的新天然候選物來治療和緩解該病。丹酚酸A是從中藥丹參中提取的一種具有生物活性的多酚化合物[3]。研究表明，丹酚酸A是一種具有多種藥理活性的多靶點藥物，如抗氧化、抗炎癥、抗纖維化、抗血小板劑和抗血栓[4-6]。丹酚酸A抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]，其對缺血再灌注急性期腦具有保護(hù)作用[8]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路在多種炎癥性皮膚病的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用[9]。然而丹酚酸A在干擾素γ(IFN-γ)和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的人皮膚HaCaT細(xì)胞損傷中的功能，及其是否通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用目前仍不清楚?；诖耍狙芯繕?gòu)建IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的人皮膚HaCaT細(xì)胞損傷模型[10-11]，考察了丹酚酸A對細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響，并評估了丹酚酸A在HaCaT細(xì)胞損傷過程的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑 人皮膚HaCaT細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。丹酚酸A(純度≥98%)購自成都曼斯特生物公司。高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；IFN-γ、TRAIL購自美國PeproTech公司；佛波酯購自美國Sigma公司；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(inter leukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國eBioscience公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3)、IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)一抗購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，在37 ℃、5% CO2、濕潤環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT檢測HaCaT細(xì)胞活性 收集對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為1×104/孔，37 ℃孵育24 h，分別加入2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L丹酚酸A[8]，同時將不含丹酚酸A的細(xì)胞作為正常培養(yǎng)組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。處理結(jié)束后，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL反應(yīng)4 h，然后加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處光密度(OD)值。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 細(xì)胞處理與分組 MTT篩選出最佳丹酚酸A給藥濃度(10 μmol/L)后，將細(xì)胞HaCaT隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組(正常培養(yǎng)的細(xì)胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL組(50 μg/L IFN-γ和4 μg/L TRAIL聯(lián)合處理HaCaT細(xì)胞48 h[12])、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A處理細(xì)胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、0.5 μmol/L 佛波酯處理細(xì)胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、PBS處理細(xì)胞HaCaT)，給藥時先加入10 μmol/L丹酚酸A處理2 h，再進(jìn)行IFN-γ、TRAIL聯(lián)合處理。處理結(jié)束后收集細(xì)胞，按“1.3”項下方法檢測HaCaT細(xì)胞的活性。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT細(xì)胞凋亡 按“1.4”項下方法收集HaCaT細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/mL，重懸于緩沖液，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL充分混合，混勻后于室溫避光反應(yīng)，15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測HaCaT細(xì)胞凋亡。

1.6 ELISA法檢測IL-6、IL-1β水平 按“1.4”項下方法收集HaCaT細(xì)胞，嚴(yán)格按照相關(guān) ELISA試劑盒的步驟檢測IL-6、IL-1β水平。

1.7 Western blot檢測cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá) 按“1.4”項下方法處理細(xì)胞后，采用RIPA裂解液提取蛋白，通過BCA試劑盒定量后取30 μg蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β肌動蛋白(β-actin)一抗(1∶1 000)，在4 ℃下過夜孵育，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)孵育2 h，使用ECL增強(qiáng)發(fā)光液顯色，曝光，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞存活率的影響 如表1所示，與正常培養(yǎng)組比較，不同濃度丹酚酸A分別作用于人皮膚HaCaT細(xì)胞24、48、72 h，細(xì)胞存活率呈先下降后升高再下降的趨勢，以10 μmol/L丹酚酸A效果最顯著，故后續(xù)選擇該濃度進(jìn)行實驗。

表1 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.2 丹酚酸A對IFN-γ、TRAIL聯(lián)合處理HaCaT細(xì)胞存活率的影響 如表2所示，與正常培養(yǎng)組比較，IFN-γ+TRAIL組24、48、72 h細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組24、48、72 h細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。

表2 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 如圖1、表3所示，與正常培養(yǎng)組比較，IFN-γ+TRAIL組細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、IL-6和IL-1β水平均升高(P<0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組HaCaT細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、IL-6和IL-1β水平降低(P<0.05)。

表3 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

圖1 各組HaCaT細(xì)胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)(B)

2.4 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞NF-κB信號通路的影響 如圖2、表4所示，與正常培養(yǎng)組比較，IFN-γ+TRAIL組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。

表4 丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞NF-κB信號通路的影響

圖2 各組HaCaT細(xì)胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

2.5 佛波酯抑制丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用 如圖3、表5所示，與IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組24、48、72 h細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.0.5)，p-IκBα蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。

表5 佛波酯抑制丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞存活率的保護(hù)作用

圖3 各組細(xì)胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

2.6 佛波酯促進(jìn)丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子分泌 圖4、表6顯示，與IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及IL-6、IL-1β水平升高(P<0.05)。

表6 佛波酯促進(jìn)丹酚酸A對HaCaT細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子分泌

圖4 各組細(xì)胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)(B)

3 討論

表皮的主要功能是提供屏障，保護(hù)人體免受環(huán)境因素的影響。角質(zhì)形成細(xì)胞是角蛋白產(chǎn)生的表皮細(xì)胞，約占表皮細(xì)胞的90%[13]。角質(zhì)形成細(xì)胞除了維持皮膚的生化和物理狀態(tài)，也參與各種炎癥性皮膚病的發(fā)展，其釋放炎癥介質(zhì)，例如促炎細(xì)胞因子和趨化因子，以響應(yīng)包括紫外線，過敏原和化學(xué)制劑在內(nèi)的免疫觸發(fā)[14]。在本研究中，以體外培養(yǎng)的人皮膚HaCaT細(xì)胞為對象，采用IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)損傷HaCaT細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A對細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用與調(diào)控NF-κB途徑有關(guān)，為特應(yīng)性皮炎的藥物開發(fā)提供了新的啟示。

細(xì)胞凋亡是角質(zhì)形成細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下的另一個重要生理因素[15]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種程序化形式，它是一種嚴(yán)格調(diào)控的生化過程，通過多種與蛋白酶(如降解蛋白質(zhì)的caspases)激活相關(guān)的不同機(jī)制發(fā)生。caspase-3被認(rèn)為是最重要的執(zhí)行因子，可被任何一種啟動子caspase(caspase-8、-9或-10)激活[16]。炎癥因子IL-1β和IL-6等過度表達(dá)與特應(yīng)性皮炎相關(guān)，并參與病理反應(yīng)的誘導(dǎo)，被認(rèn)為是皮膚炎癥發(fā)病的關(guān)鍵因素[17]。本實驗中，丹酚酸A提高IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，提示丹酚酸A通過可以促進(jìn)IFN-γ和TRAIL聯(lián)合損傷的HaCaT細(xì)胞增殖，并減少細(xì)胞凋亡。同時，丹酚酸A降低了IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的人皮膚HaCaT細(xì)胞中炎癥因子IL-6和IL-1β的分泌，說明丹酚酸A可以減輕人皮膚HaCaT細(xì)胞損傷后的炎癥反應(yīng)。由此可見，在IFN-γ和TRAIL聯(lián)合損傷的HaCaT細(xì)胞中，丹酚酸A一方面促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力和抑制凋亡，另一方面抑制細(xì)胞中炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮保護(hù)作用，與丹酚酸A在其他模型損傷中[7-8]的功能相符。

NF-κB家族包括被各種刺激激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如TNF-α、IFN-γ和脂多糖等[18]。刺激后，細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB復(fù)合物易位至細(xì)胞核，并參與眾多促炎基因的表達(dá)[19]。NF-κB信號通路已被證明與HaCaT細(xì)胞炎癥有關(guān)[20]，IFN-γ和TNF-α可以激活角質(zhì)形成細(xì)胞中的NF-κB途徑[21]。本研究中，IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)使HaCaT細(xì)胞內(nèi)p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高，使用丹酚酸A處理則抑制了此作用，提示丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制NF-κB信號通路活性而實現(xiàn)的。另外，NF-κB信號通路激活劑佛波酯能夠抑制丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯(lián)合損傷的HaCaT細(xì)胞存活率的促進(jìn)作用，并能促進(jìn)丹酚酸A對細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌的抑制作用。這些結(jié)果證實，抑制NF-κB信號通路是丹酚酸A在IFN-γ和TRAIL聯(lián)合損傷的HaCaT細(xì)胞中發(fā)揮藥效的重要途徑。

總之，丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)效果，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并抑制凋亡和細(xì)胞炎癥因子的分泌，這種保護(hù)作用可能與調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)。