大黃素對高脂飼料誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響

夏 麗，田維毅*，王和生*，李妹娟，張 磊，賴陳岑

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550000)

近年來，心血管疾病的發(fā)生及死亡呈日益年輕化、增長化趨勢，作為其重要病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化的預(yù)防與治療已成為重點研究對象。作為一種慢性炎癥疾病，從血管內(nèi)脂質(zhì)條紋產(chǎn)生到纖維斑塊，再進(jìn)展為動脈粥樣斑塊，到斑塊不穩(wěn)定和破裂，炎癥反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全過程[1]，始終都能檢測到各種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)，例如巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞介素等炎癥因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，制首烏中的大黃素具有抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、降低血脂的作用[2]。本研究旨在研究大黃素對單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)的影響，為今后防治動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與飼料 雄性SPF級C57BL/6 J小鼠12只，ApoE-/-小鼠60只，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黔)2012-0001，實驗操作符合倫理委員會要求。高脂飲食按照21%精煉豬油、0.15%膽固醇、78.85%基礎(chǔ)飼料比例制作[3]。

1.2 藥物、試劑與儀器 大黃素(黃色粉末，純度98.7%，貨號BH20150716，西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)；血脂康(批號Z10950029，北京北大維信生物科技有限公司)。小鼠MCP-1 ELISA試劑盒(貨號EMC113)、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(貨號EMC101)均購自欣博盛生物科技有限公司；脂多糖(貨號L2880，美國Sigma公司)。實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)、微電腦PCR儀(型號C1000)均購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 動物模型建立及給藥 將60只成年雄性ApoE-/-小鼠普通飼料喂養(yǎng)1周，隨機分為模型組，大黃素高、中、低劑量組，陽性對照組，每組12只。正常對照組為ApoE-/-小鼠的背景鼠C57BL/6 J成年小鼠，健康雄性，共12只，以基礎(chǔ)飼料常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃生理鹽水；給藥組小鼠基于高脂飲食，大黃素高、中、低劑量組分別灌胃40、20、10 mg/kg藥物，陽性對照組灌胃200 mg/kg血脂康，連續(xù)6周。

2.2 血液、心肌組織采集 給藥6周后隔1 d，小鼠禁食12 h，眼球取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清用于生化及ELISA檢測，取小鼠心臟并縱向剪開，得到的心肌組織放入RNA保存液用于提取RNA。

2.3 生化指標(biāo)檢測 通過全自動酶標(biāo)儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平。

2.4 RT-qPCR檢測小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γmRNA表達(dá) 按說明書提取心肌組織RNA，根據(jù)試劑盒說明書，冰上配制各組反應(yīng)液，進(jìn)行RT-qPCR分析，反應(yīng)條件為預(yù)變性50 ℃，120 s；95 ℃，600 s；熱循環(huán)，95 ℃，15 s；退火60 ℃，60 s，40次循環(huán)。采用2-△△CT法計算mRNA表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測血清IFN-γ、MCP-1水平 于對照品孔內(nèi)滴加梯度濃度對照品，樣品孔內(nèi)滴加待測樣品，37 ℃水浴鍋孵育90 min，洗板5次，甩凈，于空白孔中滴加抗體稀釋液，其余孔中滴加抗體工作液，37 ℃水浴鍋孵育60 min，洗板5次，甩凈，空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加酶結(jié)合物工作液，37 ℃水浴鍋孵育30 min，洗板5次，每孔滴加顯色底物液，封板膠覆蓋反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋孵育15 min，每孔滴加終止液后，置于酶標(biāo)儀內(nèi)，檢測吸光度。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平變化 與正常對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)，HDL-C水平均升高(P<0.01)，見圖1。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。圖1 各組小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平

3.2 各組小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γ的mRNA表達(dá) 與正常對照組比較，模型組MCP-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，IFN-γmRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組MCP-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，IFN-γmRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γ mRNA表達(dá)

3.3 各組小鼠血清MCP-1、IFN-γ水平 與正常對照組比較，模型組MCP-1水平升高(P<0.05)，IFN-γ水平減低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素低、中劑量組和陽性對照組血清MCP-1水平降低(P<0.01)，IFN-γ水平升高(P<0.01)，大黃素高劑量組血清MCP-1、IFN-γ水平均降低(P<0.01)，見圖3。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。圖3 各組小鼠血清MCP-1、IFN-γ水平

4 討論

動脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，主要涉及脂類代謝、炎癥與氧化應(yīng)激等。上世紀(jì)90年代動脈粥樣硬化的炎癥理論提出后[4]，逐漸被世界廣泛接受。血脂與動脈粥樣硬化之間關(guān)系已是眾所周知，現(xiàn)在大多數(shù)認(rèn)可，TC、TG、LDL-C的發(fā)展誘導(dǎo)動脈粥樣硬化，尤其ox-LDL刺激泡沫細(xì)胞生成從而釋放出更多的炎癥介質(zhì)加重，而HDL-C則是幫助減少其發(fā)生發(fā)展[5]。MCP-1是巨噬細(xì)胞分泌的促炎癥因子，是加速形成動脈粥樣硬化的重要因素之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，患有動脈粥樣硬化內(nèi)膜斑塊的患者，體內(nèi)血清MCP-1的水平高于正常組[6]。既往研究表明，MCP-1不僅可以趨使單核細(xì)胞聚集，加速泡沫細(xì)胞形成，還可以對白介素、腫瘤壞死因子等其余促炎癥因子產(chǎn)生影響，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速動脈粥樣硬化斑塊形成[7-8]。IFN-γ曾用名叫巨噬細(xì)胞活化因子，為水溶性二聚體，是Ⅱ型干擾素。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠建模成功后主動脈壁斑塊免疫組化中可見IFN-γ呈現(xiàn)陽性，表達(dá)高于正常組[9]。IFN-γ是雙向調(diào)節(jié)因子，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。另有學(xué)者報道通過調(diào)控IFN-γ可以改善動脈粥樣硬化的病變程度[10]，在巨噬細(xì)胞中抑制極低密度脂蛋白受體表達(dá)，抑制泡沫細(xì)胞形成[11]。

大黃素作為制首烏游離蒽醌主要成分，具有抗炎、抗氧化、降低血脂等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，制首烏游離蒽醌抗動脈粥樣硬化作用可能通過上調(diào)ABCA1，調(diào)控血脂，影響血清NO水平，降低NF-κB、IL-1β表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)[12-14]。本研究結(jié)果顯示，模型組TC、TG、LDL-C水平較正常對照組升高，提示動脈粥樣硬化模型復(fù)制成功；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組TC、TG、LDL-C均有不同程度的下降，提示大黃素可以加速TC、TG、LDL-C的分解，促進(jìn)血清中HDL-C的合成，起到有良好的調(diào)脂作用。從基因表達(dá)上看，本研究模型組中MCP-1 mRNA表達(dá)升高，IFN-γmRNA表達(dá)降低，這與文獻(xiàn)報道一致，進(jìn)一步說明MCP-1伴隨著動脈粥樣硬化的發(fā)展。通過大黃素干預(yù)后，MCP-1 mRNA表達(dá)降低，IFN-γmRNA表達(dá)升高，提示大黃素可以降低MCP-1、升高IFN-γmRNA表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。ELISA檢測MCP-1水平變化趨勢與基因表達(dá)基本一致。大黃素中、低劑量干預(yù)后IFN-γ水平升高，而高劑量組表現(xiàn)不同，考慮是大黃素高劑量組在轉(zhuǎn)錄過程中能升高IFN-γ的表達(dá)，但其翻譯修飾等各種因素出現(xiàn)蛋白變化，具體表現(xiàn)差異有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究以ApoE-/-小鼠為對象，炎癥與動脈粥樣硬化的關(guān)系為切入點，觀察大黃素對炎癥因子MCP-1、IFN-γ的影響。結(jié)果表明，大黃素可以通過調(diào)控MCP-1、IFN-γ抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，具有抗炎及抗動脈粥樣硬化的作用，為臨床防治動脈粥樣硬化及藥物的開發(fā)提供了新思路。