左歸丸對(duì)卵巢切除骨質(zhì)疏松癥模型小鼠骨代謝的機(jī)制

李 微，徐紅丹，宋 肖，張 博，趙文豪，邵 帥，黃樹明*

(1.湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身系統(tǒng)性的骨骼退行性病變，多發(fā)生在老年群體，尤其是絕經(jīng)后的老年女性[1]。隨著老齡人口的增多，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率出現(xiàn)了逐年攀升的趨勢(shì)，引起了社會(huì)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生有多方因素，包括性激素的減少、鈣離子的流失、身體各器官機(jī)能的減退、內(nèi)分泌的失調(diào)以及其他疾病和藥物誘導(dǎo)等因素。該病嚴(yán)重影響著中老年人甚至年輕人的身體健康與生活質(zhì)量，給社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。因此，急需找到預(yù)防和治療這類疾病的有效措施。

補(bǔ)腎法是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論制定的臨床預(yù)防和治療骨病的基本治則，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎在體為骨，骨乃腎所主”，故“腎主骨”理論是研究人員選則用藥的主要理論依據(jù)[2-3]。本課題選用補(bǔ)腎古方左歸丸，該方是由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、菟絲子、川牛膝、龜板膠、鹿角膠、八味中藥組成，其功效為滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，且諸多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其對(duì)骨質(zhì)疏松癥，生殖、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有保護(hù)作用[4-5]。本研究采用雌激素剝奪的方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型[6]，探究左歸丸通過(guò)雌激素/雌激素受體途徑影響骨代謝的機(jī)制，為臨床上采用補(bǔ)腎法治療骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路和方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)未孕雌性小鼠72只，C57BL/6品系，8～10周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(黑)2013-0004。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 MUTISKANMK3型酶標(biāo)儀、-80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；CT15RE型4 ℃低溫離心機(jī)(日本Hitachi公司)；PH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；SVC-1000型全自動(dòng)交流穩(wěn)壓器(浙江常安集團(tuán)有限公司)；制膠工具、電泳儀、多層濾紙、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；半干轉(zhuǎn)膜電泳儀、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2.2 試劑 小鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(貨號(hào)P0013B)、PMSF(貨號(hào)ST506)、超敏ECL發(fā)光液(貨號(hào)P0 018 A)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)PC0020)、4×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)P1015)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號(hào)P1300)(北京索萊寶科技有限公司)；5×SDS loading Buffer(貨號(hào)S0137)、Western一抗稀釋液(貨號(hào)M3001)、Western二抗稀釋液(貨號(hào)M3101)(哈爾濱?；锟萍加邢薰?；乙二胺四乙酸[福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司]；十二烷基硫酸鈉、吐溫80、甘氨酸、Tris-HCL、Tris-base、TRIS、Base(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；PVDF膜、預(yù)染蛋白Marke(貨號(hào)26616)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；聚合HRP標(biāo)記抗兔lgG(貨號(hào)SV0002)(武漢博士德生物工程有限公司)；ERα Antibody(貨號(hào)AF6058)(美國(guó)Affinity公司)；ERβ Antibody(貨號(hào)bs-0116R)、鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號(hào)bs-0061R)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(貨號(hào)WLA022a)(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.2.3 水煎液制備及劑量確定 左歸丸組方藥材熟地20 g、枸杞10 g、牛膝7.5 g、山茱萸10 g、鹿角膠10 g、山藥10 g、龜板膠10 g、菟絲子10 g，均購(gòu)自哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為正品，制成水煎液，方法為取出鹿角膠和龜板膠，其余藥材用自來(lái)水浸泡30 min后煎制2次，合并藥液，加入打成粉的鹿角膠和龜板膠進(jìn)行煬化處理，攪拌均勻后濃縮成固定體積的貯備液。陽(yáng)性對(duì)照藥采用戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂)(批號(hào)214 A)[拜耳醫(yī)藥(上海)有限公司]。成人日用量1 mg，換算成小鼠為每天0.13 mg/kg，小鼠每天灌胃容量為0.01 mL/g，雌二醇溶液含藥量為0.013 mg/mL，配制好后置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。氟維司群ICI82780(貨號(hào)129453-61-8)(美國(guó)Selleck公司)。成人的臨床用量為每個(gè)月肌內(nèi)注射250 mg，換算成小鼠給藥劑量為每個(gè)月32 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)按照2倍成人劑量給藥，即64 mg/kg。

2 方法

2.1 分組、建模及取材 采用雙側(cè)卵巢摘除的方法制備骨質(zhì)疏松癥小鼠模型，造模1個(gè)月后隨機(jī)分模型組，雌二醇組，左歸丸高、中、低劑量組，阻斷劑組，每組12只，按0.01 mL/g體質(zhì)量灌胃給藥，左歸丸成人臨床服用的劑量為9 g/次，每天2次，換算成小鼠給藥劑量為每天2.34 g/kg，灌胃容量為0.01 mL/g。左歸丸高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予質(zhì)量濃度為0.936、0.468、0.234 mg/mL的左歸丸水煎液，假手術(shù)組、模型組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水，雌二醇組小鼠灌胃給予0.013 mg/mL相應(yīng)溶液，阻斷劑組肌肉注射64 mg/kg ICI182780后按照左歸丸高劑量組劑量給藥，各組均連續(xù)給藥8周。

給藥8周后，小鼠稱定體質(zhì)量，摘取眼球取血，室溫下靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，取血后取出脛骨、股骨、L4-6段腰椎骨，脛骨置于4 ℃冰箱中，用4%多聚甲醛固定48 h；股骨迅速放置于液氮中速凍后，移至-80 ℃冰箱中；L4-6段腰椎骨用浸生理鹽水的紗布包裹，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 脛骨組織中ER表達(dá) 取出固定的小鼠脛骨組織，放入EDTA溶液中進(jìn)行脫鈣處理，用常規(guī)方法(脫水、透明、浸蠟)石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠脛骨近心端ERα、ERβ的表達(dá)。

2.3 股骨組織中ER蛋白表達(dá) 取出凍存的小鼠股骨組織，采用Western blot法檢測(cè)小鼠股骨中ERα、ERβ蛋白表達(dá)。

2.4 雌激素受體阻斷劑對(duì)左歸丸骨代謝作用的干預(yù)作用 ICI182780干預(yù)后，測(cè)定小鼠骨密度、骨代謝相關(guān)因子、ERα蛋白表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)方法如前期報(bào)道所述[1]。

3 結(jié)果

3.1 左歸丸對(duì)小鼠脛骨中ER表達(dá)的影響 電子顯微鏡下觀察到雌激素受體陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或黃褐色的顆粒，胞質(zhì)和胞核均有表達(dá)，蛋白表達(dá)量越多，顏色越深，見圖1A～1B。模型組小鼠脛骨骨松質(zhì)部分ERα、ERβ表達(dá)均低于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，雌二醇組及左歸丸高、中劑量組小鼠ERα表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，雌二醇組及左歸丸高劑量組小鼠ERβ表達(dá)升高(P<0.01)，見圖1C。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組小鼠脛骨骨松質(zhì)ER表達(dá)(免疫組化DAB染色，×400)

3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 圖2顯示，模型組小鼠股骨ERα、ERβ蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.01)，表明卵巢摘除后雌激素水平下降，雌激素受體表達(dá)減少；與模型組小鼠比較，雌二醇組及左歸丸高、中、低劑量組均可使小鼠ERα表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)，雌二醇組小鼠ERβ表達(dá)升高(P<0.01)，但左歸丸各劑量組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3.3 雌激素受體阻斷劑對(duì)左歸丸骨代謝作用的影響 表1顯示，與左歸丸組比較，左歸丸+阻斷劑組小鼠骨密度減少(P<0.01)，ALP、StrACP活性及OC水平升高(P<0.05，P<0.01)。圖3顯示，與左歸丸組比較，左歸丸+阻斷劑組小鼠ERα受體減少，其灰度比值與左歸丸組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組小鼠股骨ERα、ERβ蛋白表達(dá)

表1 ICI182780干預(yù)后各組小鼠骨密度及骨代謝相關(guān)因子水平

注：與模型組比較，##P<0.01；與左歸丸組比較，&&P<0.01。圖3 ICI182780干預(yù)后各組小鼠股骨ERα表達(dá)

4 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的致病原因主要是雌激素的撤退，在中醫(yī)學(xué)上認(rèn)為絕經(jīng)前后的諸多癥狀及內(nèi)分泌失衡的病機(jī)均為腎虛，故補(bǔ)腎成為了治療的根本所在[7-8]。雌激素作為一種重要的內(nèi)源性激素，在體內(nèi)的變化影響著很多生理代謝過(guò)程，包括生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼等[9-10]。本研究前部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明左歸丸對(duì)雌激素剝奪導(dǎo)致的骨損傷具有保護(hù)作用[11]。因此為了探究左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分析左歸丸對(duì)雌激素及雌激素受體的影響。

前期研究檢測(cè)了左歸丸水煎液對(duì)于骨質(zhì)疏松癥模型小鼠血清中的雌激素水平的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定了各組小鼠血清中雌二醇的水平，結(jié)果證明左歸丸水煎液的各劑量組均不能使卵巢摘除小鼠血清中雌激素水平升高，這說(shuō)明了左歸丸對(duì)骨組織的雌激素樣作用并不是通過(guò)增加體內(nèi)的雌激素水平而實(shí)現(xiàn)的[12]。本研究檢測(cè)了左歸丸對(duì)卵巢摘除小鼠雌激素受體表達(dá)的影響，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定ERα和ERβ在脛骨近心端骨松質(zhì)上的表達(dá)情況，分析各組平均累計(jì)光密度值，結(jié)果表明左歸丸對(duì)ERα和ERβ的表達(dá)均有明顯的影響。同時(shí)利用Western blot技術(shù)分析了ERα和ERβ在股骨中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)各電泳條帶的灰度結(jié)果，表明左歸丸能夠增加ERα的表達(dá)，對(duì)ERβ無(wú)明顯影響。這個(gè)結(jié)果預(yù)示著左歸丸水煎液對(duì)骨組織的作用很可能是通過(guò)增加ERα表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

為了驗(yàn)證左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥模型小鼠的骨保護(hù)作用機(jī)制是通過(guò)增加雌激素受體的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，選擇ICI82780進(jìn)行干預(yù)研究。ICI182780，是一種非特異性的雌激素受體阻斷劑，他不同于其他的抗雌激素藥物具有類雌激素樣作用(如他莫昔芬)，所以可以規(guī)避很多雌激素過(guò)量導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

據(jù)先前研究ICI182780能夠完全阻斷淫羊藿素、去甲基肉毒堿[14]和獐芽菜苷[15]對(duì)骨細(xì)胞的增殖和分化作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明，當(dāng)給小鼠注射ICI182780后再給予左歸丸水煎液進(jìn)行治療后與左歸丸給藥組比較，小鼠骨組織中的ERα表達(dá)降低，小鼠腰椎的骨密度下降，血清中骨代謝相關(guān)因子ALP、StrACP和OC升高，即左歸丸對(duì)骨的保護(hù)作用被阻斷。

總之，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左歸丸可通過(guò)增加小鼠骨骼上ERα的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)骨代謝的作用，為臨床上左歸丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供理論支持，也為闡明“腎主骨”理論的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。