卵巢早衰動物模型的研究進展

馬 瑞，崔曉萍，李祖昂，鄭 娜，肖新春

（陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 712046）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、FSH＞40 IU·L-1和雌激素水平降低，并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀[1-3]的一種疾病。目前該病的發(fā)病率占1%～3%[4]，并處于不斷上升的狀態(tài)。導致POF的病因復雜多樣，大體上可將其分為遺傳因素、環(huán)境因素、代謝因素、自身免疫因素、身心應激因素、醫(yī)源性因素等幾大類，該疾病在人體研究困難且卵巢組織難以獲取，為進一步研究該疾病的治療方案，給更多患者帶來福祉，許多學者通過建造動物模型來深入研究該疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療，本文現(xiàn)將能搜集到的造模方法匯集在一起，旨在為更多研究者建立動物模型提供便捷。

1 動物模型建立方法

1.1 化學藥物POF造模法

隨著惡性腫瘤、免疫性疾病化療后患者存活率的提高，加之在女性發(fā)病逐漸年輕化，藥物作用機體后帶來的生殖問題也不斷涌現(xiàn)，其中以環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、順鉑、雷公藤多甙片和氫化可的松對卵巢功能影響較為明顯。為提高治療后育齡期婦女的生育功能和生活質量，多數(shù)學者選擇用化療藥物來構建POF的動物模型。常用藥物及方法如下。

1.1.1 CTX 作為常用化療藥物之一的CTX，具有高度卵巢毒性作用，可作用于細胞DNA而引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂，以致DNA、RNA和蛋白質的合成被抑制[5]，損傷性腺組織。Plowchalk[6]等和Meirow[7]等研究發(fā)現(xiàn)，CTX對各級卵泡均有破壞作用，其中以原始卵泡破壞最為嚴重。張娟[8]等將家兔隨機分組，分別給家兔注射50 mg·kg-1的CTX 1 d（A組）、50 mg·kg-1連續(xù)注射2 d（B組）、按照8 mg·kg-1連續(xù)注射14 d（首日注射50 mg·kg-1）（C組）三種方法建立模型。經(jīng)注射CTX后，模型組體重與對照組相比明顯下降，并出現(xiàn)動情周期紊亂，血清學檢測、病理學和形態(tài)學的改變。其中A組雌激素水平在7 d達高峰，后整體呈下降趨勢，但在21 d出現(xiàn)小幅度升高，原因可能由于A組劑量所致卵巢損傷是可逆的，卵巢功能沒被徹底破壞。B組雌二醇（E2）值則持續(xù)下降，且在注射CTX后第35天降至最低，比較接近臨床上POF患者低雌激素表現(xiàn)；C組體重下降迅速，且病死率高，不適宜用作造模。最終得出給家兔注射50 mg·kg-1的CTX，連續(xù)2 d是建立POF模型最佳劑量的結論。

趙雪靜[9]給2～3月齡SD大鼠連續(xù)腹腔注射不同濃度［10、20、30 mg·（kg·d）-1］的CTX 20 d，給藥結束后高、中劑量組大鼠的體質量明顯下降，動情周期紊亂，動情期及動情前期減少，總周期數(shù)較少，主要表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期；卵巢濕重減輕并出現(xiàn)病理組織、血清學的改變。低劑量組大鼠的病理學和形態(tài)學表現(xiàn)則不明顯，血清學及動情周期與對照組相比無改變。各組大鼠其他器官均無損傷，也保證了造模過程中大鼠生命體征的平穩(wěn)，最終得出CTX20mg·（kg·d）-1的實驗劑量最符合臨床POF的內分泌特征的結論。

1.1.2 雷公藤多甙片 雷公藤多甙是提取自中藥雷公藤的一種物質，目前臨床多用于治療類風濕性關節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病等自身免疫性疾病，該藥長期服用對卵巢功能會有所損害。郝娟等[10]用生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液給大鼠灌胃50mg·（kg·d）-1，連續(xù)14d，自灌藥第4天起，每日進行陰道涂片、觀察動情周期，2d測1次體質量，給藥結束后24h，大鼠給予10%水合氯醛麻醉后眶周取血，處死大鼠后觀察到子宮和卵巢的質量均較對照組明顯減輕，卵巢病理組織學和血清學檢測發(fā)生改變；子宮黏膜層明顯變薄，腺體減少，肌層變?。粍忧橹芷谘娱L，出現(xiàn)持續(xù)的動情間期或動情期延長至3d。

1.1.3 順鉑 順鉑是常用的腹腔化療藥物，其作用類似于烷化劑，主要通過干擾腫瘤細胞的DNA復制、與核蛋白和細胞質蛋白結合來達到治療腫瘤的作用[11]，在抗腫瘤細胞的同時也對機體全身系統(tǒng)造成損害。齊聰[12]給6周齡大鼠腹腔注射2mg·（kg·d）-1順鉑×5d，總劑量為10mg·kg-1（A組）、4mg·（kg·d）-1×5d（B組）、2mg·（kg·d）-1×10d（C組），B、C兩組總劑量均為20mg·kg-1，D組僅注射生理鹽水2mL·d-1×10d。其中順鉑溶液（0.5mg·mL-1）經(jīng)生理鹽水稀釋為總量2mL一次性腹腔注射。給藥后觀察到大鼠卵巢的病理學及血清學檢測發(fā)生改變，劑量大的B、C組更為明顯，得出了隨著劑量的增大、給藥時間的延長，藥物對卵巢功能的損傷越大的結論。張麗娟等[13]分別給大鼠腹腔注射4mg·kg-1和6mg·kg-1順鉑注射液，每周1次，連續(xù)2周，第2次注射7d后取材。給藥過程中觀察到大鼠體重有不同程度減輕、行動緩慢，喜蜷縮、弓背，體毛晦暗無光澤，高劑量組更為顯著。除此之外，還觀察到大鼠卵巢組織的形態(tài)學、病理學，血清學檢測發(fā)生變化。兩組大鼠的動情周期出現(xiàn)紊亂，其中低劑量組間期延長，動情期縮短，停藥后可有所恢復；而高劑量大鼠則長期停在動情間期，停藥后不會恢復，最終得出高劑量組模型更為理想的結論。

1.1.4 氫化可的松 氫化可的松為腎上腺皮質激素類藥，常用于腎上腺皮質功能減退癥的替代治療及先天性腎上腺皮質功能增生癥的治療，也可用于類風濕性關節(jié)炎、風濕性發(fā)熱、痛風、支氣管哮喘、過敏性疾病及嚴重感染和抗休克等治療。其不良反應除了出現(xiàn)庫欣綜合征外，還可對女性生殖方面產(chǎn)生不利影響。江瑜[14]等對2~3月齡雌性大鼠的后腿肌肉注射氫化可的松（10mg·mL-1），每日注射1次，連續(xù)14d，給藥后大鼠動情周期紊亂，病理組織及血清學檢測均明顯改變。王凱[15]等給8~9周齡的雌性大鼠后下肢肌肉注射氫化可的松［32mg·（kg·d）-1］，每日1次，連續(xù)12d，給藥后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、怕冷，毛無光澤、拱背少動，飲食減少，體重減輕，反應遲鈍等癥狀，動情間期持續(xù)或延長，卵巢指數(shù)降低，血清生殖激素異常，其中促卵泡成熟激素（FSH）/黃體生成激素（LH）在停止造模第1天升高，第15天略有下降。

化學藥物造模法成本低，操作簡單、方便，容易實施，建立的模型也更為穩(wěn)定，可控性強，適宜劑量保證了動物生命體征的穩(wěn)定，目前深受國內研究者們的歡迎，其中CTX應用最為廣泛。

1.2 放射療法POF造模法

放射療法是利用大量的輻射所產(chǎn)生的能量可破壞細胞的染色體，使細胞停止生長，從而消滅可快速分裂和生長的癌細胞，常作為直接或輔助治療癌癥的方式。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，放療在破壞癌細胞時也會損傷各級卵泡，其中以原始卵泡最為敏感。賀宇恒等[17]用RS2000系列生物輻射儀對小鼠進行不同程度（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy）的單次全身輻照，劑量率為1.2Gy·min-1，距離為50cm，7d后取材，可觀察到小鼠卵巢的損傷程度隨著輻射劑量的增加逐漸加重，并得出4Gy劑量是造成小鼠POF的最低適宜劑量。為進一步研究出小鼠造模的最佳時間，又觀察4Gy劑量時不同時間點（14d、21d、28d和42d）小鼠的表現(xiàn)：隨著輻照時間延長，小鼠動情周期的動情后期和動情間期在總周期所占比例延長，動情期逐漸縮短（正常規(guī)律情況下動情后期持續(xù)時間10～14h，動情間期持續(xù)時間60～70h，動情期持續(xù)時間9～15h），42d表現(xiàn)為持續(xù)動情間期；卵巢的病理學、形態(tài)學改變及血清學檢測指標變化更加明顯。與0Gy組比較，7d時原始卵泡數(shù)下降約85%，14d下降約92%，42d時卵巢內僅剩閉鎖卵泡，最后得出小鼠接受單次全身4Gy輻照后7～14d能夠建立POF理想模型的結論。該造模方法操作簡單，病死率低，容易成功，可重復性強，但與化學藥物相比較，該方法成本相對較高，并在干預過程中對其他器官也會產(chǎn)生損傷，影響實驗結果的觀察。

1.3 自身免疫性POF造模法

1.3.1 透明帶（ZP）3多肽（pZP3） ZP是包圍在哺乳動物的卵細胞的一層支持其生長的糖基化基質，其中ZP3為其中之一。1992年Rhim等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠和人ZP3蛋白具有67%的同一性，且pZP3可誘導小鼠產(chǎn)生抗ZP3抗體，與卵巢ZP3結合引起自身免疫性卵巢炎，從而引起類似于人類POF的表現(xiàn)。朱玲[19]等將由2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液與費氏完全佐劑按1∶1比例配成的免疫試劑（0.15 mL）對小鼠雙腳后掌進行皮下多點注射，2周后將用2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液與弗氏不完全佐劑按1∶1比例配制成免疫強化試劑（0.15 mL）進行腹腔注射，5周后同法再次加強免疫。在免疫后的第35天，模型組小鼠出現(xiàn)易激惹、大便干結，動情周期紊亂，在第4周、第8周時卵巢生長卵泡比率降低、應用免疫組化、Western Blot檢測的GDF-9、Smad2蛋白表達明顯下降。王佩娟等[20]將由弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）配成含有5 mg·mL-1結核桿菌H37Ra（美國BD Difco公司）的完全弗氏佐劑和用ZP3330-342氨基酸系列的多肽片段配制成1 mmol·mL-1的溶液按等比例混合配成免疫乳化劑，在第0天和第14天分別用0.1 mL乳化劑皮下注射B6AF1小鼠的腳掌和尾根。進行免疫后小鼠精神狀態(tài)明顯煩躁易怒、精神萎靡不振、反應遲鈍、行動遲緩，脾臟指數(shù)升高，胸腺、卵巢、子宮指數(shù)均下降。上述兩種造模雖不太一樣，但其大體方向一致，都可建立免疫性動物模型，該技術目前在國內較為成熟，但所需成本相對較高，并且在溶液配置過程中需要精準無誤。

1.3.2 胸腺切除 胸腺屬于中樞免疫器官，主要參與T細胞的分化和發(fā)育，切除易感品系新生期第2～5天小鼠的胸腺可發(fā)生類似人類自身免疫性卵巢疾病的典型卵巢病理學改變。涂曉娟等[21]摘除出生3 d以內雌性小鼠的胸腺，術后5周血清FSH、LH升高，伴E2下降，卵巢組織中出現(xiàn)較明顯的炎細胞浸潤及卵泡閉鎖，并且從術后5周開始，血清中炎性細胞因子轉化生長因子-β1（TGFβ1）和白細胞介素-4（IL-4）降低，而干擾素-γ（IFN-γ）和白細胞介素-21（IL-21）升高，顯示造模成功。該方法對于切除胸腺及縫合的技術要求較高，難度大，所致動物病死率高，目前尚難推行。

1.4 代謝性POF造模法

Guerreero等[22]研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖及其代謝產(chǎn)物過多堆積可導致育齡期女性原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕及POF。包秀芳[23]連續(xù)給9～12周齡的大鼠喂35%半乳糖食物（模型組）和25%的標準食物（對照組），80 d后發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠體內半乳糖含量較對照組增加，并出現(xiàn)卵巢萎縮、重量減輕，卵巢組織中卵泡發(fā)育受阻。何連利[24]通過給小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖200 mg·（kg·d）-1，6周后發(fā)現(xiàn)小鼠精神萎靡，飲食減少，體毛晦暗無光澤，卵巢系數(shù)降低，單位卵巢面積內卵泡數(shù)、黃體數(shù)減少，閉鎖卵泡數(shù)增多，F(xiàn)SH升高，E2及抗繆勒管激素值（AMH）降低。這兩種方法均表明通過增加動物體內半乳糖的含量，導致代謝物出現(xiàn)蓄積，進而導致機體代謝出現(xiàn)較為嚴重的紊亂可以建立POF的動物模型。該方法操作簡便，無須特殊儀器，目前臨床應用也較為廣泛。

1.5 過度瘦身POF造模法

高灑灑等[25]、王艷平等[26]給予模型組大鼠每日左旋肉堿灌胃600 mg·kg-1、跑臺運動（跑臺坡度為0°，跑速為28 m·min-1，20 min·d-1，運動6 d，休息1 d）、50%日常攝食量，且灌胃在運動前30 min進行。造模過程中發(fā)現(xiàn)干預4周和干預8周的大鼠體質量均下降，且干預8周的大鼠體質量下降更為明顯，較原始值下降了23%，較空白組下降了35%，而干預4周的大鼠體質量較原始值下降了17%，較空白組下降了26%。給予恢復飲食后，造模4周的大鼠體質量恢復至空白組的98%；造模8周的大鼠體質量恢復為空白組的83%。模型組大鼠除體質量下降外，還有精神不振，活動減少，反應遲鈍，煩躁不安，拱背易驚，體毛粗糙無光澤，對疼痛敏感，動情周期紊亂，血清學檢測發(fā)生改變，表示造模成功。這是近年來新出現(xiàn)的一種造模方法，成本經(jīng)濟、耗時也短。

1.6 基因敲除POF造模法

基因敲除是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的分子生物學技術。目前研究較多的就是敲除PTEN和FOXL2基因。PTEN基因是通過影響脂質磷酸酶的活性，抑制PI3K-Aktm TOR通路，從而調控細胞增殖、存活和能量代謝[27]，Reddy[28]發(fā)現(xiàn)，小鼠去除PTEN基因2 d時無明顯原始卵泡，同時，F(xiàn)SH和LH明顯升高，對照組則仍有62.9%的卵泡為原始卵泡；Pisarska等[29]研究FOXL2基因在鼠卵巢中卵泡發(fā)育和成熟階段的表達，提出野生型FOXL2的顯性負突變可能會增加中、小卵泡中StAR和其他卵泡分化基因的表達，從而加速卵泡發(fā)育，導致休眠卵泡的初始募集增加出現(xiàn)POF表型。Uda等[30]通過發(fā)現(xiàn)小鼠體內FOXL2基因被破壞后，小鼠顆粒細胞停止發(fā)育，卵母細胞逐漸閉鎖，8周時原始卵泡池耗竭，16周時卵巢無正常的卵母細胞和卵泡，致使小鼠不孕，表明了FOXL2基因與卵泡的發(fā)育有關。本方法有助于我們了解某特定基因對于POF的作用，但一種模型僅能研究一兩個基因的作用，而POF的發(fā)生并非幾種基因改變所致，對于其病因學的研究有所限制，并且操作起來難度大、成本高。

1.7 應激型POF造模法

應激是指機體在遇到各種不利的刺激后，會通過調節(jié)神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生一系列反應，會擾亂生理或心理狀態(tài)?，F(xiàn)代社會中女性正承擔著越來越多的責任及壓力，機體常處于應激狀態(tài)，常出現(xiàn)月經(jīng)失調、閉經(jīng)、不孕等疾病。阿卜力孜·克熱木等[31]通過給予大鼠濕寒和強光環(huán)境，即溫度為（7±1）℃、濕度為（85±5）%，每日晚8點至早8點持續(xù)同等強度光照（40W日光燈直射，距離2.5 m），早8點至晚8點放置黑暗環(huán)境，避免一切光照，連續(xù)20周后，觀察到大鼠血E2、β-EP水平降低FSH、LH的水平顯著升高，卵巢組織中未見明顯的初級、次級卵泡，偶見原始卵泡，囊狀閉鎖卵泡增多，空泡樣變化多，說明卵巢水腫嚴重，間質腺增生且伴有纖維化，得出持續(xù)慢性應激可誘發(fā)POF。該方法經(jīng)濟易行，容易操作，但造模周期相對較長，需要對大鼠生活的環(huán)境嚴格調控，也是近年來比較熱的一種造模方法。

綜上所述，各類造模方法各有特點，本文通過查閱近10年文獻發(fā)現(xiàn)目前應用最為廣泛的是CTX、雷公藤多甙及注射ZP3建立的POF模型，其中CTX和雷公藤多甙兩種模型建立時更經(jīng)濟便捷，且用時短，建立的模型更穩(wěn)定。應激和過度瘦身造模是近年來新出現(xiàn)的方法，操作簡單，更切合臨床中當今廣大女性的生活方式。而基因敲除、胸腺切除的造模方法在操作過程中難度極大，對于實驗室條件要求也高，目前采用的較少?？傊?，建立理想的動物模型有諸多困難，研究者在具體實驗研究時根據(jù)實驗目的和實驗條件選擇合適的模型則非常重要，期待日后有更多對于POF的病因、病機及治療的完善的研究。