4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲生長和凋亡的影響

潘厚軍，康佳磊，張德鋒，常藕琴，任 燕，王亞軍，蔣俊賢，王 琳，石存斌

（中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業(yè)農村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380）

長期以來寄生蟲疾病給魚類養(yǎng)殖造成了巨大的經濟損失，且難以得到有效控制。寄生蟲侵襲魚體，不但引起魚類生長發(fā)育緩慢，抵抗力下降，苗種大量寄生時還可直接引起大量死亡，造成較大的經濟損失[1]。其中纖毛類寄生蟲對魚類苗種危害尤為嚴重，例如多子小瓜蟲 (Ichthyophthirius multifiliis) 感染，死亡率可高達90%，甚至造成“全軍覆滅”。由于寄生蟲具有依賴于宿主才能完成其生活史的特性，其離體培養(yǎng)非常困難，這是寄生蟲藥物篩選的技術瓶頸[1]。

嗜熱四膜蟲 (Tetrahymena thermophila) 是一種單細胞真核生物，在分類地位上隸屬于原生動物門、纖毛綱，因其可在實驗室條件下純培養(yǎng)、具有成熟的分子操作技術和清晰的遺傳背景而成為一種被廣泛研究的模式生物[2-4]。采用嗜熱四膜蟲，不僅在細胞和分子生物學方面獲得重要成果，在藥物研發(fā)方面也取得了重要進展，已有部分學者分析了多種藥物對嗜熱四膜蟲生長繁殖、氧化應激、基因表達等方面的影響[5-10]，為嗜熱四膜蟲作為模式生物、篩選抗蟲藥物奠定了前期研究基礎。

研究發(fā)現，在魚類養(yǎng)殖過程中，中草藥及其有效成分如青蒿 (Artemisia annua)[11]、大黃 (Rheum palmatum)[12]、黃連 (Coptis chinensis)[13]等的使用不僅可以預防寄生蟲病害[14-15]，還可以提升魚體的免疫力[16]和抗氧化性能[17]，是控制魚類寄生蟲病藥物篩選的寶庫。中草藥單體是從中草藥的根、莖、葉等部位中提取并高度純化的物質，其化學成分明確，作用機理可循[18-19]，是良好的替抗藥物的候選。本研究以康奈爾大學惠贈的嗜熱四膜蟲Cu428.2株為實驗對象，研究青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿 (又名黃連素) 4種中草藥單體對Cu428.2蟲株增殖、氧化應激指標活性以及細胞凋亡的影響，以期建立利用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥的方法。

1 材料與方法

1.1 嗜熱四膜蟲蟲株、培養(yǎng)基及試劑

嗜熱四膜蟲Cu428.2株由美國康奈爾大學惠贈；Neff培養(yǎng)基配方為多價蛋白胨2.5 g，酵母提取物 2.5 g，D-無水葡萄糖 5.0 g，9.0 g·L-1三氯化鐵 (FeCl3) 儲存液1.0 mL，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌30 min，常溫保存；總超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (Catalase,CAT)、丙二醛 (Malonyldialdehyde, MDA) 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Hoechst 33258染色試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司出品。

1.2 儀器與設備

Elipse Ti數碼倒置熒光顯微鏡 (日本Nikon公司)；IC 1000 (Countstar) 細胞計數儀(上海瑞鈺生物科技公司)；ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)；3K-15高速冷凍離心機 (德國Sigma公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.3 中草藥單體

4種中草藥單體詳見表1。分別稱取中草藥單體100 mg，加入10 mL助溶劑二甲基亞砜(DMSO，細胞培養(yǎng)級別，Sigma-Aldrich公司)，即刻加入無菌水 90 mL，配成含 1.0 mg·mL-1(1.0 g·L-1) 藥液的母液，DMSO體積分數為10% (0.1 mL·mL-1)，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時加適量培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

表1 實驗的4種中草藥單體Table 1 Four kinds of Chinese herbal monomers used in experiment

1.4 嗜熱四膜蟲的活化培養(yǎng)

取室溫保存的嗜熱四膜蟲，以5%接種于10 mL Neff培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，至對數生長期，再按照培養(yǎng)基總體積的2% (1.0 mL)接種于 49 mL Neff培養(yǎng)基中，28 ℃ 100 r·min-1培養(yǎng)24 h至對數生長初期。

1.5 Hoechst 33 258檢測細胞凋亡

取對數生長期的嗜熱四膜蟲按終密度5.5×104個·mL-1接種于50 mL反應體系的Neff培養(yǎng)液中。設置對照組 (DMSO 20 mg·L-1) 和中草藥單體實驗組 (質量濃度分別為 2.0、20、200 mg·L-1)，于 28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng) 48 h 后，10 000 r·min-1離心5 min收集細胞，棄上清。加沉淀2～3倍體積的Hoechst 33258染色液，室溫避光培養(yǎng)20 min，2 000 r·min-1離心5 min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS, pH 7.4) 洗2次，取20 μL細胞懸液滴在載玻片上，加入抗熒光淬滅封片液，并蓋上潔凈的蓋玻片。熒光顯微鏡紫外光下觀察細胞凋亡形態(tài)。

1.6 細胞計數與細胞活力測定

1.6.1 藥物暴露 對數生長期的嗜熱四膜蟲按終密度 5.5×104個·mL-1接種于50 mL 反應體系的Neff培養(yǎng)液中，加入死亡率介于0～100% (需經預實驗)、按常用對數間距0.2設置6個質量濃度(5.0、8.0、12.5、20、32、50 mg·L-1) 的受試藥物及10% DMSO溶劑組，每個濃度組設置3個平行，并設置空白對照 (僅培養(yǎng)基) 及不加藥物對照(有培養(yǎng)基、嗜熱四膜蟲，不加藥物)，于28 ℃、100 r·min-1的搖床中培養(yǎng)暴露處理24 h，進行細胞計數和CCK-8法細胞活力測定。

1.6.2 細胞計數 取待測的嗜熱四膜蟲試液，用75%乙醇以1∶1固定，取20 μL加入Countstar計數板，使用Countstar細胞計數儀測定細胞數量，實驗重復3次，計算平均值 (±SD)。以中草藥單體質量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標，嗜熱四膜蟲密度(104個·mL-1) 為縱坐標，繪制嗜熱四膜蟲密度在不同濃度單體作用下的折線圖。同時采用SPSS 20.0軟件計算藥物對嗜熱四膜蟲生長的半抑制濃度(IC50)和95%置信區(qū)間 (95% CI)。

1.6.3 CCK-8細胞活力 取藥物處理后的嗜熱四膜蟲試液，加入96孔板，每孔加入10 μL的CCK-8試劑混勻，28 ℃培養(yǎng)4 h，使用酶標儀450 nm處測定吸光度 (A)。CCK-8活力計算公式為：細胞活力 (T/C, %)=[(A實驗-A空白)]/[(A對照-A空白)]×100%。每個濃度設6個復孔，實驗重復3次，計算平均值(±SD)。

參考1.6.2 的方法，以中草藥單體質量濃度(mg·L-1) 為橫坐標，CCK-8 細胞活力 (T/C, %) 為縱坐標，繪制細胞活力在單體作用下的折線圖，同時采用SPSS 20.0軟件計算藥物對嗜熱四膜蟲生長的IC50和 95% CI。

1.7 氧化應激指標測試

根據1.6中 IC50的結果，設置50 mL (Neff培養(yǎng)基+中草藥單體) 試液體系，質量濃度按等對數間距，4個藥物均設置1.25、3.2、5.0、8.0、12.5、20.0、32.0、50 mg·L-1的試液，每個濃度分別設置3個平行，另設置DMSO對照組。移取對數生長期的嗜熱四膜蟲，按5%的比例至各實驗體系中，28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng)，即置于有藥物的試液中處理4 h，10 000 r·min-1離心10 min，去上清，留沉淀提取嗜熱四膜蟲細胞，使用PBS洗2遍，在冰上勻漿。4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min，將上清液吸出，分裝入凍存管 -80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂媚暇┙ǔ缮锕境銎返腟OD、CAT、MDA檢測試劑盒，測定不同濃度中草藥單體作用下的酶活力，具體測試方法參照試劑盒說明。

以藥物質量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標，酶活力(U·mg-1) 為縱坐標，繪制嗜熱四膜蟲的3種酶活力在中草藥單體作用下的柱形圖。采用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計處理分析，組間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，分析4種中草藥單體對SOD、CAT、MDA的影響。

2 結果

2.1 中草藥單體對嗜熱四膜蟲凋亡的影響

不同濃度的4種中草藥單體 (青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 對嗜熱四膜蟲處理24 h后，經過Hoechst 33258 染色，結果見圖1。隨著藥物濃度的增加，產生強熒光的著色細胞增多，4種中草藥單體藥物高濃度處理組 (20～200 mg·L-1) 比對照組的細胞著色明顯增加，大量嗜熱四膜蟲的細胞核呈濃染致密、明亮鮮艷的顆粒狀熒光。2.0 mg·L-1處理組，除青蒿素外，3種藥物的凋亡細胞亦比對照組顯著增加，其中青蒿素2.0 mg·L-1處理組凋亡細胞比對照組少。

圖1 4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲Cu428.2凋亡的影響 (Hoechst 33258試劑染色)A. 青蒿素；B. 大黃素；C. 蘆薈大黃素；D. 小檗堿；1、2、3、4示藥物質量濃度分別為0、2.0、20、200 mg·L-1。Figure 1 Effect of four kinds of Chinese herbal monomers on apoptotic morphology of T. thermophila Cu428.2 (stained by Hoechst 33258)A. Artemisinin; B. Emodin; C. Aloe-emodin; D. Berberine; 1, 2, 3 and 4 show the monomer concentration as 0, 2.0, 20, 200 mg·L-1; respectively.

2.2 中草藥單體對嗜熱四膜蟲種群增長和細胞活力的影響

將4種中草藥單體稀釋成不同濃度，分別處理嗜熱四膜蟲，細胞計數法測得的嗜熱四膜蟲活細胞密度和CCK-8法測得的細胞活力結果見圖2，2種方法計算的IC50結果見表2。CCK-8法與活細胞計數法結果較為一致，隨著3種中草藥單體 (大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 濃度的增加，采用計數法測量的活細胞密度、CCK-8法測量的細胞活力均降低；而青蒿素在低質量濃度 (5.0 mg·L-1) 增加，質量濃度≥8.0 mg·L-1降低。

表2 活細胞計數法、CCK-8法測得的4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲的半抑制濃度Table 2 50% inhibitory concentration (IC50) of four kinds of Chinese herbal monomers to T. thermophila Cu428.2 determined by living cell counting method and CCK-8 test

圖2 不同濃度的4種單體作用下嗜熱四膜蟲Cu428.2株的活細胞密度和CCK-8細胞活力a. 活細胞密度；b. CCK-8細胞活力。Figure 2 Cell Density and CCK-8 Cell viability of T. thermophila Cu428.2 at different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomersa. Living cell density; b. CCK-8 cell viability.

IC50結果為：采用細胞計數法，抑制作用由強到弱依次為蘆薈大黃素＞大黃素＞青蒿素＞小檗堿；采用CCK-8法，亦為蘆薈大黃素＞大黃素＞青蒿素＞小檗堿；而數值大小略有不同。結果表明，2種方法測得的數據趨勢一致而數值有一定差別。結合2種方法評估中草藥單體對嗜熱四膜蟲的作用較好。

2.3 中草藥單體對嗜熱四膜蟲酶活力的影響

嗜熱四膜蟲經中草藥單體處理4 h后，SOD、CAT、MDA酶活力測定結果見圖3。結果表明，在1.25～50 mg·L-1的藥物濃度范圍內，隨著藥物濃度的增加，SOD活性先升高后降低；而CAT有升高趨勢，MDA有降低趨勢。表明該4種中草藥單體對此3種酶活力指標的影響具有一致性，而具體在某一濃度下對某種酶的活力影響有所不同。

圖3 嗜熱四膜蟲Cu428.2在4種中草藥單體分別處理后超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛活力*. 與對照組差異顯著 (P＜0.05)；**. 與對照組差異極顯著 (P＜0.01)。Figure 3 SOD, CAT and MDA activity of T. thermophila Cu428.2 after treatment of four kinds of Chinese herbal monomers*. The difference is significant with the control group (P＜0.05); **. The difference is extraordinary significant with the control group (P＜0.01).

3 討論

隨著水產養(yǎng)殖中大量化學藥物的使用，水體環(huán)境污染愈發(fā)嚴重，也增強了寄生蟲的抗藥性。開發(fā)綠色環(huán)保、無污染、無抗性的中草藥防治魚類養(yǎng)殖中的病害刻不容緩。中草藥單體成分明確、效應明顯，是今后中草藥應用的方向之一。青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素和小檗堿均是中草藥單體物質，前人的研究顯示其有抗蟲效應，如青蒿素對瘧原蟲[20-21]、血吸蟲[21]和球蟲[21]有效，大黃素對瘧原蟲[22]、蘆薈大黃素對利什曼原蟲[23]和瘧原蟲[24]有效，小檗堿除對利什曼原蟲[25]有效外還對多種原蟲和蠕蟲有效[15]。本研究同時分析4種單體對嗜熱四膜蟲的效應，結果表明，青蒿素、蘆薈大黃素、小檗堿、大黃素等4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲增殖的影響有劑量效應關系，在一定濃度下可致嗜熱四膜蟲凋亡，具有抑制生長的作用，與鉤吻堿(Koumine，斷腸草里提取的一種生物堿)[9]對嗜熱四膜蟲的效應有類似之處。有意思的是，青蒿素在低濃度時有促進生長的作用，可能在低濃度時其作為培養(yǎng)基營養(yǎng)成分起了主要作用，這與柴小翠等[26]報道的低濃度竹節(jié)參 (Panax japonicus) 能促進生長的分析相似。

本研究主要采用Hoechst染色、細胞計數法和CCK-8法3種不同的方式進行實驗，以探究4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲的抑制生長效應。Hoechst染料具特異性強、熒光性能強、實驗方式快捷的優(yōu)點，試劑穿過細胞膜與DNA相結合進行染色，當細胞發(fā)生凋亡時，染色質固縮，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光，或呈碎塊狀致密濃染，發(fā)出強烈藍色熒光，與背景形成鮮明對比。凋亡細胞與活細胞對比明顯，從而可以直觀地分析藥物在一定濃度范圍是否有凋亡作用。嗜熱四膜蟲的計數方法以往是固定后采用血細胞計數板，人為誤差較大且較煩瑣，本研究采用Countstar細胞計數儀，成像后采用電腦直觀計算細胞數量，可減少人為誤差，且快捷方便。CCK-8法是一種WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的黃色甲瓚產物 (Formazan dye)，生成的甲瓚物顏色深淺與活細胞數量成正比，因而可以采用酶標儀定量分析，是一種靈敏度較高、重復性好的細胞活性檢測方法，適合在分析藥物對細胞增殖影響、細胞活性檢測等實驗中應用[27]。CCK-8法步驟較為簡單，相對于細胞計數法更客觀、穩(wěn)定性更強，是一種較為理想的測試藥物對嗜熱四膜蟲影響的研究方法。本研究采用3種不同的實驗方法，對4種中草藥單體處理后嗜熱四膜蟲的影響進行評估，在Hoechst熒光染色形態(tài)觀察的基礎上進行細胞計數和CCK-8實驗，獲得中草藥單體的IC50數據，準確可行。本研究表明，在中草藥單體作用下，嗜熱四膜蟲隨著藥物濃度的變化，用細胞計數法和CCK-8實驗分別獲得的活細胞數和細胞活力呈現相同的趨勢；獲得的IC50具有一致性，但數據有所區(qū)別。筆者認為，CCK-8法更為客觀，必要時結合細胞計數法分析則更為可靠。

為探究嗜熱四膜蟲凋亡的機理，本研究分析了中草藥單體對嗜熱四膜蟲氧化應激的影響。已有研究表明，這4種中草藥單體對動物抗氧化作用有顯著影響[28-31]。SOD、CAT和MDA是生物體和細胞內3種重要的氧化應激指標，其中SOD和CAT是生物體內極其重要的抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基 ()，具有非常大的破壞作用，能夠引起細胞死亡和器官衰老，SOD被認為是防衛(wèi)傷害的第一步，它可以將轉化為毒性較低的H2O2[32]；而CAT可進一步將H2O2轉化為H2O和O2，保護細胞免受損傷[33]。MDA是生物體或細胞內一種脂質氧化的產物，反映脂質氧化的水平[34]。本研究的4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲SOD活性的影響，相較于對照組，基本為先升高后降低的趨勢，與潘厚軍等[7]報道的苯甲酸鈉、廖苑辰等[35]研究的氧化石墨烯對嗜熱四膜蟲SOD的影響均為低濃度促進、高濃度抑制的結果相似，具有劑量效應關系，原因亦為低濃度刺激了嗜熱四膜蟲致SOD活力增強，而高濃度使細胞產生毒害致自由基清除能力下降；本研究與在鉤吻堿[9]和百草枯[36]作用下嗜熱四膜蟲SOD活性均升高的結果有所差異，可能是因為嗜熱四膜蟲對不同藥物在不同濃度下的氧化應激適應性有所差異所致。本實驗中草藥作用后，CAT含量有升高趨勢，與有機紫外防曬劑[37]、抗菌劑三氯生[38]對嗜熱四膜蟲CAT的影響一致，而與抗菌劑三氯卡班[38]不同。單體作用于嗜熱四膜蟲后，嗜熱四膜蟲的MDA水平降低，其中蘆薈大黃素的效果尤為明顯，表明蘆薈大黃素能顯著降低嗜熱四膜蟲的脂質水平，這與張瑩瑩等[39]報道的蘆薈大黃素降低小鼠非酒精性脂肪肝模型的血清MDA水平結果一致。

本研究表明，中草藥單體可引起纖毛類寄生蟲的替代模式生物——嗜熱四膜蟲凋亡，對嗜熱四膜蟲增殖和凋亡的影響具有劑量效應關系。為解決寄生蟲離體培養(yǎng)困難而致抗蟲中草藥篩選的瓶頸問題，本研究探討了體外應用嗜熱嗜熱四膜蟲的途徑。中草藥在魚類寄生蟲的防控實踐中是否有效，仍有待進行魚體臨床試驗。本研究結果為抗魚寄生蟲中草藥大通量篩選的體外技術提供了可能途徑。

4 結論

采用Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下觀察，濃度為20～200 mg·L-1的青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿等4種中草藥單體可引起嗜熱四膜蟲凋亡；中草藥單體對嗜熱四膜蟲Cu428.2株的增殖具有抑制效應，采用CCK-8法與活細胞計數法測得的IC50較為一致；在單體濃度為1.25～50.0 mg·L-1，隨著藥物濃度的升高，CAT有升高趨勢，而MDA活性有降低趨勢，SOD先升高后降低。研究結果可為應用嗜熱四膜蟲篩選抗寄生蟲中草藥平臺技術的建立提供方法。