新發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者WB 帶型特征與CD4+T 淋巴細(xì)胞檢測(cè)分析

吳亞云，孫怡華，虞 瑩，范偉林，蔣甜甜，繆阿敏

（江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心微檢科，南通 226007）

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是人體感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的自身免疫功能障礙的嚴(yán)重傳染性疾病。人體感染HIV 后，病毒主要攻擊CD4+T 淋巴細(xì)胞（CD4 positive T-lymphocyte，CD4），使該細(xì)胞數(shù)量呈進(jìn)行性或不規(guī)則降低[1-2]，CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果用于AIDS 的分期和判斷療效[3]；免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot，WB）為HIV 抗體確證的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，HIV 結(jié)構(gòu)基因主要包括編碼包膜蛋白的env 基因、編碼聚合酶蛋白的pol基因和編碼核心蛋白的gag 基因[5]，由于病毒感染后免疫系統(tǒng)反應(yīng)存在個(gè)體差異且各類蛋白濃度不同，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白抗體檢出情況不一致，WB 結(jié)果出現(xiàn)多種特征性條帶[6]。為了解本地區(qū)新發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染人群的WB 帶型特征與感染后免疫缺陷情況，共收集本區(qū)域內(nèi)294例HIV-1 抗體陽(yáng)性者的WB 帶型及免疫細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2020 年1—12 月南通市新發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染且自愿配合采集靜脈血進(jìn)行CD4 細(xì)胞檢測(cè)者，共294例。所有HIV-1 感染者均符合《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》（WS293-2019）中AIDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：（1）至少有2 條env 帶（gp41 和gp160/gp120）出現(xiàn)，或至少1 條env 帶和至少1 條gag 或pol 帶同時(shí)出現(xiàn)；（2）符合國(guó)家批準(zhǔn)的HIV 抗體確證試劑盒提供的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)南通市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 HIV-1 抗體確證試驗(yàn) 采用WB 法，儀器為CycleBlot 48 蛋白印跡儀（麗珠公司），檢測(cè)試劑由安倍生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司提供。

1.2.2 CD4/CD8/CD3/CD45 淋巴細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞微球計(jì)數(shù)法，儀器為BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），試劑為原裝配套試劑。

1.2.3 試驗(yàn)結(jié)果 嚴(yán)格按照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2020 年修訂版）》和試劑盒說(shuō)明書判讀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel 表匯總。依據(jù)《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》（WS293-2019）[3]將新發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者進(jìn)行分期：CD4 細(xì)胞≥500/mm3為無(wú)免疫缺陷，350～＜500/mm3為輕度免疫缺陷，200～＜350/mm3為中度免疫缺陷，＜200/mm3為重度免疫缺陷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和Levene′s 檢驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不滿足χ2檢驗(yàn)者則進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（K-W 檢驗(yàn)），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 294例感染者年齡15～81 歲，平均（46.58±14.50）歲；男244例（83.0%），年齡15～81 歲，平均（45.00±14.61）歲；女50例（17.0%），年齡33～76歲，平均（54.26±11.24）歲；男女比例約為4.9∶1。不同年齡、性別HIV-1 感染者分組見表1。

2.2 CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 294例感染者CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)為1～1 042/mm3，其中<200/mm3占42.2%、200～<350/mm3占37.4%、350～<500/mm3占13.6%、≥500/mm3占6.8%。

檢測(cè)對(duì)象30 歲以上者CD4 細(xì)胞檢測(cè)值主要集中在<200/mm3和200～<350/mm3兩個(gè)區(qū)間，CD4 細(xì)胞檢測(cè)值在不同年齡組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在不同性別之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同年齡、性別HIV-1 感染者CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)組分布（n，%）

2.3 WB 帶型結(jié)果 294例感染者中，32.3%為全帶型（gp160、gp120、gp41、p66、p55、p51、p39、p31、p24、p17），67.7%為非全帶型。其中env 基因編碼的包膜蛋白抗體gp160、gp120、gp41 的檢出率均為100.0%；pol 基因編碼的聚合酶蛋白抗體包括p66、p51、p31，檢出率分別為96.3%、90.1%和90.5%，平均檢出率為92.2%；gag 基因編碼的核心蛋白抗體p24 為96.6%、p55 為37.8%、p39 為41.5%、p17 為58.2%，平均檢出率為58.5%。

根據(jù)年齡、性別對(duì)WB 帶型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p17 和p39 抗體條帶在不同年齡分組之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），≤30 歲組高于其他年齡組。p55 抗體條帶女性檢出率大于男性（P<0.05），見表2。

表2 不同年齡、性別HIV-1 陽(yáng)性者WB 帶型分布統(tǒng)計(jì)（n，%）

2.4 HIV-1 帶型與CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)系 199例非全帶型中，以出現(xiàn)7 條確證條帶居多，達(dá)83例（41.7%）；出現(xiàn)8 條確證條帶者56例（28.1%），分析發(fā)現(xiàn)檢出條帶的總數(shù)與CD4 細(xì)胞檢測(cè)值分組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。env 基因編碼蛋白抗體全帶檢出率為100.0%，pol 基因編碼蛋白抗體全帶檢出率為86.4%，gag 基因編碼全帶檢出率為32.3%。WB 確證條帶的主要類型有：全帶型32.3%、p55+p39+p17 缺失型35.4%、p55+p39 缺失型19.7%、p55 缺失型4.1%、p55+p17 缺失型3.1%，其他類型條帶均不超過(guò)5 條，見表3；分析結(jié)果顯示pol 基因編碼全帶的檢出或缺失，與CD4 細(xì)胞分組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與p55、p31 抗體條帶分析結(jié)果一致，見表4；p55+p39+p17 條帶同時(shí)缺失在男性中的構(gòu)成比更大，但是在不同性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；全帶型和gag 全帶型在≤30 歲年齡組中構(gòu)成比更高；缺失p55+p39+p17 條帶類型在＞50 歲組中占比約50%，見表5。

3 討論

HIV/AIDS 的診斷原則是以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為依據(jù)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)和參考流行病學(xué)資料。HIV 抗體陽(yáng)性和HIV 病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性是確診HIV 感染的依據(jù)；CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)和臨床表現(xiàn)是HIV 感染臨床診斷分期的主要依據(jù)[4]。

表3 WB 主要帶型分布與CD4 檢測(cè)結(jié)果的分布（n，%）

表4 不同免疫狀況HIV 陽(yáng)性抗體者WB 帶型分布（n，%）

pol 基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。pol 基因編碼蛋白全帶均檢出在輕度免疫缺陷狀態(tài)的檢出率明顯低于其他分組，其中p51、p31抗體條帶也符合此規(guī)律，提示pol 基因編碼的聚合酶蛋白抗體在疾病進(jìn)展進(jìn)入艾滋病期時(shí)可能由于病毒大量復(fù)制而一過(guò)性缺失。

表5 不同年齡、性別分組WB 帶型分布（n，%）

env 與pol 基因編碼蛋白抗體條帶檢出率高，而gag 基因編碼蛋白抗體條帶除p24 外，其他條帶檢出率較低，與黃妙琳等[7]的研究結(jié)果一致，略低于劉萌萌等[8]的分析結(jié)果。當(dāng)疾病進(jìn)展到艾滋病期，機(jī)體免疫力低下，病毒大量復(fù)制消耗p24 抗體[9]，WB 法檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為缺失。本研究結(jié)果中p24 抗體條帶缺失10例，均進(jìn)入了重度免疫缺陷狀態(tài)，與李楠等[10]的結(jié)果一致；本研究認(rèn)為雖然p24 抗體條帶在各免疫缺陷分組中均維持高檢出率，但并未隨病程發(fā)生明顯變化，此時(shí)如結(jié)合病毒載量及定量抗體試驗(yàn)進(jìn)一步分析則更利于臨床診療中判斷病情。

當(dāng)gag 基因編碼的核心蛋白抗體全部檢出時(shí)，全條帶均能檢出，意味著抗體條帶的缺失主要出現(xiàn)在p55、p39 和p17 中。WB 確證實(shí)驗(yàn)中主要出現(xiàn)的帶型為：（1）全帶型；（2）p55+p39+p17 缺失；（3）p55+p39缺失；（4）p55 缺失；（5）p55+p17 缺失。p55+p39+p17 缺失帶型在不同年齡組間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），＞50 歲年齡組中近半數(shù)出現(xiàn)此類型缺失。而各帶型在不同免疫缺陷分組下的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[11-12]有所不同。

綜上所述，HIV 感染后除了env 基因編碼的包膜蛋白抗體呈持續(xù)檢出狀態(tài)外，其他蛋白抗體條帶會(huì)因個(gè)體免疫反應(yīng)的不同產(chǎn)生多種特征性WB 條帶的組合，綜合分析WB 條帶的檢出情況和CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)，可協(xié)助HIV 感染分期診斷，判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)。