肝細(xì)胞癌患者癌旁肝組織中COX-2 高表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)*

周煒林，顧春燕，肖靜文，肖 鋒*

（江蘇省南通市第三人民醫(yī)院，南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院病理科，南通 226006）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的實體瘤之一，在全世界癌癥相關(guān)死亡中居第3位。在東亞、東南亞和非洲，HCC 的發(fā)病率尤其高[1]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，由COX-1 和COX-2 兩種亞型組成，COX-1 在組織中廣泛表達(dá)，而COX-2 在組織中選擇性表達(dá)。COX-2 在結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌中有高水平表達(dá)，其表達(dá)與癌細(xì)胞的侵襲性、患者預(yù)后和生存率密切相關(guān)。COX-2 代謝物前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的增加可以促進(jìn)上皮癌細(xì)胞的生長、存活和侵襲[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 在HCC癌旁肝組織中有表達(dá)，并與癌組織中表達(dá)水平不一致。COX-2 在癌旁肝組織中的表達(dá)是否具有臨床意義，目前還缺乏相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008 年1 月—2017 年12 月期間南通市第三人民醫(yī)院病理科存檔的HCC 患者石蠟樣本344例，所有患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均按標(biāo)準(zhǔn)程序采集和處理：組織樣本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片4 μm。收集患者的一般資料（性別、年齡等），及其他臨床特征包括腫瘤大小、乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）情況、有無肝硬化、組織學(xué)分級、微血管侵犯等。術(shù)后隨訪時間為8～114 個月。本研究經(jīng)患者知情同意并通過南通市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 制備組織芯片 首先對所有HCC 病例的HE切片重新閱片，挑選代表性癌組織及癌旁2 cm 以內(nèi)肝組織的位置，并在對應(yīng)蠟塊上作標(biāo)記。隨后用儀器打孔制成模塊，用吸針從樣本蠟塊吸取組織，按照設(shè)定的排列順序裝載在新制作模塊蠟塊中。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟樣本組織切片，厚度4 μm；二甲苯脫蠟3 次，5 min/次；梯度乙醇復(fù)水；然后切片在去離子水中浸泡5 min。高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)。待切片自然冷卻后，室溫下用3%H2O2處理10 min，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌；用含3%牛血清白蛋白的PBS 封閉1 h。之后，滴加一抗COX-2（Santa Cruz 公司，1∶200），4 ℃孵育過夜，隨后在37 ℃下與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗（Leica 公司）孵育1 h；然后用顯色劑3，3′-二氨基聯(lián)苯胺處理切片，并用蘇木精復(fù)染；最后，切片用去離子水洗滌，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實驗設(shè)置陰性對照和陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 在腫瘤細(xì)胞和癌旁肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到清晰的棕色時，判定為COX-2 陽性。由兩位受過專業(yè)培訓(xùn)的病理醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行評定。首先在低倍鏡下整體評估切片，選取陽性染色熱點區(qū)（染色最強(qiáng)區(qū)域）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。同時計數(shù)陽性細(xì)胞所占百分比及評價染色強(qiáng)度，至少計數(shù)2 000 個細(xì)胞。陽性細(xì)胞所占的百分比分級標(biāo)準(zhǔn)：<5%為0 分；5%～＜25%為1 分；25%～＜50%為2 分；50%～＜75%為3 分；≥75%為4 分。染色強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)：未見染色為0 分；弱棕色為1 分；棕色為2 分；棕褐色為3 分。兩項評分相乘、再相加，取平均值即為最后的評分，分為4 個等級：0～1 分，陰性（-）；2～4 分，弱陽性（+）；5～8分，中度陽性（++）；9～12 分，強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗，COX-2 表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2蛋白在HCC 癌旁肝組織及癌組織中的表達(dá)情況 COX-2 蛋白表達(dá)定位于HCC 癌旁肝組織及癌組織的細(xì)胞質(zhì)中，呈均勻細(xì)顆粒狀（圖1）。COX-2 蛋白在HCC 癌旁肝組織中的表達(dá)率高于癌組織（χ2=4.896，P=0.027）（表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測COX-2 在HCC 癌及癌旁肝組織中的表達(dá)情況

2.2 COX-2 在HCC 癌旁肝組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果顯示，COX-2 在HCC 癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級、微血管侵犯及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)（均P<0.05）。COX-2 在癌旁肝組織中表達(dá)與患者HBsAg 陽性、有肝硬化、微血管侵犯及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)（均P<0.05）（表2）。

表1 COX-2 蛋白在肝細(xì)胞癌及對應(yīng)的癌旁肝組織中的表達(dá)

3 討論

HCC 在南通地區(qū)發(fā)病率高。目前的數(shù)據(jù)[3]顯示：近80%的HCC 患者都有慢性肝炎、肝硬化的基礎(chǔ)病變。盡管通過手術(shù)完整切除腫瘤，但HCC 復(fù)發(fā)率居高不下。越來越多的研究[4]表明腫瘤周圍的肝細(xì)胞分子生物學(xué)功能及所處的微環(huán)境已經(jīng)發(fā)生了某些分子及功能的改變，這些變化進(jìn)一步導(dǎo)致單中心或多中心性的肝細(xì)胞癌變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。故研究癌旁肝組織的生理生化狀態(tài)對于評估HCC 患者復(fù)發(fā)風(fēng)險具有十分重要的意義。

表2 HCC 癌組織及癌旁肝組織中COX-2 的表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性

COX-2 參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，如調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力以及促進(jìn)腫瘤新生血管的生成等[5]。本研究結(jié)果顯示COX-2 在癌旁肝組織中的表達(dá)率高于癌組織，提示癌旁肝組織的分子生物學(xué)性能、細(xì)胞微環(huán)境等可能發(fā)生了改變。

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示COX-2 在HCC 癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級、微血管侵犯及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，這與之前的報道[6]相一致，進(jìn)一步驗證了COX-2 在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。COX-2 在癌旁肝組織中表達(dá)與患者HBsAg 感染、肝硬化情況呈正相關(guān)，提示COX-2 可能參與肝炎、肝纖維化的病理生理過程[7]。值得注意的是，COX-2 在癌旁肝組織中表達(dá)與微血管侵犯及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，這一結(jié)果提示COX-2在癌旁肝組織中高表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌變過程中的重要分子事件，基于COX-2 的重要分子生物學(xué)功能，筆者推測：COX-2 過表達(dá)可能通過相關(guān)分子信號途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生克隆性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。

首先，有研究[8]顯示COX-2 的過度表達(dá)能改變細(xì)胞某些增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。COX-2 能催化花生四烯酸生成前列腺素，其中PGE2 可誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)，Bcl-2 是凋亡抑制分子，其過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。其次，COX-2 具有一定程度的免疫抑制功能。COX-2 催化產(chǎn)物PGE2 可抑制腫瘤微環(huán)境中T 淋巴細(xì)胞的募集，同時還能抑制自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)[9]；另外可以誘導(dǎo)有免疫抑制功能的白細(xì)胞介素-10 的產(chǎn)生，進(jìn)而使癌細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視和免疫攻擊。第三，COX-2 可促進(jìn)新生血管和淋巴管的形成。有關(guān)COX-2 在腫瘤組織中表達(dá)促進(jìn)血管或淋巴管生成的研究早有報道[10]，文獻(xiàn)[7]結(jié)果顯示：COX-2 在腫瘤周圍肝組織，尤其是肝硬化組織中的表達(dá)上調(diào)，可通過旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而導(dǎo)致HCC 侵襲門靜脈或肝靜脈，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)；另外，COX-2 還可以通過上調(diào)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)淋巴管形成，導(dǎo)致腫瘤通過淋巴管轉(zhuǎn)移。

綜上，COX-2 可能參與HCC 復(fù)發(fā)過程，為一步探討復(fù)發(fā)性HCC 的分子機(jī)制提供新的思路，也為臨床擬定提前干預(yù)措施提供新的依據(jù)。