離心分配色譜法對(duì)達(dá)烏里芯芭中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離純化

夏 瑩，張明旭，秦 玲，高 冰,李旻輝,

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.包頭醫(yī)學(xué)院)

達(dá)烏里芯芭(Cymbaria dahurica L.)是一種多年生草本，別名芯芭、大黃花和白蒿茶，蒙名興安奈-哈吞-額布斯，主要生于典型草原、荒漠草原和山地草原上，在內(nèi)蒙古呼倫貝爾市、赤峰市、烏蘭察布、包頭市等地區(qū)廣泛分布。達(dá)烏里芯芭是一種傳統(tǒng)蒙藥材，蒙藥名為韓琴色日高，以全草入藥，具有祛風(fēng)濕、止血利尿等功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)過(guò)多、吐血、腎炎水腫、黃水瘡等病癥[1]。

目前對(duì)于達(dá)烏里芯芭化學(xué)成分的研究主要集中于環(huán)烯醚萜等成分[2]。在課題組的前期研究中，首次發(fā)現(xiàn)達(dá)烏里芯芭中含有毛蕊花糖苷(Acteoside)和異毛蕊花糖苷(Isoacteoside)[3]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。毛蕊花糖苷具有廣泛的藥理活性，如腎功能保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗高血壓等作用[4]。異毛蕊花糖苷也在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了防止神經(jīng)紊亂和認(rèn)知障礙等作用[5]。

圖1 毛蕊花糖苷(Acteoside)和異毛蕊花糖苷(Isoacteoside)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

離心分配色譜法(centrifugal partition chromatography, CPC)是現(xiàn)代逆流色譜法中的一種液-液分配色譜技術(shù)。物質(zhì)分離的原理是基于其在兩種不相容的溶液中不同的分配系數(shù)而實(shí)現(xiàn)的，其簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、適合分離天然產(chǎn)物中活性成分的特性受到研究人員的青睞[6]。雖然在以往的研究中，已有對(duì)其他植物中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離，如曹馨元等人使用中壓柱色譜技術(shù)分離制備毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷單體[7]、常敬娟使用制備液相色譜分離了北美車(chē)前草中的毛蕊花糖苷[8]。而離心分配色譜可以實(shí)現(xiàn)更高的生產(chǎn)效率和更低的生產(chǎn)成本，對(duì)毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

本研究旨在探索一種使用離心分配色譜法對(duì)達(dá)烏里芯芭中的毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進(jìn)行分離純化的方法，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)達(dá)烏里芯芭產(chǎn)業(yè)化的開(kāi)發(fā)利用和毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的廣泛應(yīng)用提供途徑。

1 材料與試劑

1.1藥材來(lái)源 達(dá)烏里芯芭藥材于2018年6月采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗賀斯格烏拉農(nóng)牧場(chǎng)馬希拉哈達(dá)。樣品由包頭醫(yī)學(xué)院生藥教研室張春紅教授鑒定為玄參科(Scrophulariaceae)芯芭屬(Cymbaria L.)的植物達(dá)烏里芯芭(Cymbaria daurica L.)。

1.2試劑與儀器 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào): HE141730198)、異毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào): HA141444298)采購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。十萬(wàn)分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；IKA RV 10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海焓佩機(jī)電設(shè)備有限公司)；XJB-40-B型純水儀(沈陽(yáng)欣潔科技有限公司)；PLC 2050離心分配色譜設(shè)備(北京吉爾森科技有限公司)；UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)熱電公司)；分液漏斗、燒杯等玻璃儀器產(chǎn)于四川屬牛玻璃儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取 稱(chēng)取干燥達(dá)烏里芯芭全草1 450 g，將其粉碎成中細(xì)粉(過(guò)四號(hào)篩)。采用加熱回流法，用70 %乙醇提取1 h(物料比1∶10)，靜置冷卻后過(guò)濾提取液。按照上述方法反復(fù)提取3次。合并提取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，得到醇提取物粗浸膏362.5 g。將醇提取物粗浸膏加水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，各部分萃取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏，最終得到石油醚部位浸膏55.91 g，乙酸乙酯部位浸膏21.47 g，正丁醇部位浸膏110.77 g和水部位浸膏174.26 g。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷主要存在于正丁醇部分。

2.2毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離 將乙酸乙酯、正丁醇和超純水按照體積比4∶1∶5的比例充分混合，配備離心分配色譜溶劑系統(tǒng)[9]。溶劑系統(tǒng)在分液漏斗中靜置過(guò)夜，取上相作為固定相，下相為流動(dòng)相。將固定相和流動(dòng)相分別在常溫，80W的條件下，超聲15 min除氣泡備用。稱(chēng)取萃取得到的正丁醇浸膏樣品101.3 mg溶解在10 mL下相中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為樣品備用。

高速離心分配色譜儀器設(shè)置為降相模式，以10 mL/min的流速和500 r/min的轉(zhuǎn)速將固定相泵入色譜柱中；12 min后，調(diào)節(jié)流速為3 mL/min，轉(zhuǎn)速為1500 r/min后再注入流動(dòng)相，18 min達(dá)到平衡狀態(tài)，即可進(jìn)樣。

將樣品由進(jìn)樣閥注入，設(shè)定高速離心分配色譜儀器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間90 min，用紫外檢測(cè)器在320 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，自動(dòng)收集到樣品管中(每管10 mL)。收集液均經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)鑒定，將組分相同部分進(jìn)行合并。合并后的組分再次注入進(jìn)樣閥，高速離心分配色譜儀器設(shè)定運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間90 min，用紫外檢測(cè)器在320 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，自動(dòng)收集到樣品管中(每管10 mL)，收集液經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)鑒定，將相同部分合并。最終將合并液進(jìn)行減壓濃縮至干，得到目標(biāo)化合物毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷,并計(jì)算得率。得率計(jì)算公式如下：

2.3結(jié)果 所得樣品均為白色粉末，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)對(duì)比，樣品1為毛蕊花糖苷4.41 mg，純度為95.49 %, 得率為0.33 %；樣品2為異毛蕊花糖苷0.89 mg，純度為94.83 %，得率為0.07 %。如圖2所示。

圖2 毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷高效液相色譜圖

3 討論

苯乙醇苷類(lèi)化合物毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在自然界中分布廣泛，可以從肉蓯蓉、地黃等多種植物中提取分離得到[10-11]。這兩種化合物均展現(xiàn)出多種藥理作用且具有低毒，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，但是傳統(tǒng)的提取分離方法相對(duì)困難、繁瑣，給其深入研究帶來(lái)了很大困難。離心分配色譜法因其快速、高效、低浪費(fèi)的特性，有助于化合物大量分離純化時(shí)獲得更大經(jīng)濟(jì)效益。因此將該種方法應(yīng)用于芯芭中化合物的分離純化，對(duì)于促進(jìn)達(dá)烏里芯芭資源利用開(kāi)發(fā)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)首次采用了一種離心分配色譜法對(duì)達(dá)烏里芯芭中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進(jìn)行分離純化且純度較高。相比其他方法，該方法高效便捷，為達(dá)烏里芯芭藥用植物的工業(yè)化發(fā)展提供一種途徑。