重組抗VEGF單抗工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留ELISA檢測(cè)方法的建立與驗(yàn)證

鄧春平，梅雄，王星，劉翠華

·論著·

重組抗VEGF單抗工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留ELISA檢測(cè)方法的建立與驗(yàn)證

鄧春平，梅雄，王星，劉翠華

519085 廣州，百奧泰生物制藥股份有限公司（鄧春平、梅雄、劉翠華）；63110 St. Louis，ArrayBridge Inc.（王星）

建立重組抗 VEGF 單抗中 CHO 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCPs）殘留的 ELISA 檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。采用空載 CHO 細(xì)胞制備工藝特異 HCPs，并進(jìn)行二維電泳表征；采用二維電泳-Western blot（2D SDS-PAGE/Western blot）法對(duì) 6 種抗 CHO HCPs 多克隆抗體（C3、C6、C7、AB000103-A、AB000103-C、3G-0016-AF）識(shí)別重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進(jìn)行測(cè)定；選擇覆蓋率最高的多抗作為檢測(cè)抗體，建立制品工藝特異性 HCPs ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)方法的線性、基質(zhì)干擾、稀釋線性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證；此外對(duì)該方法與商業(yè)化通用檢測(cè)方法進(jìn)行了橋接對(duì)比研究。制備的工藝特異性 HCPs 蛋白質(zhì)譜分布廣泛；篩選得到覆蓋率為 59% 的 C6 兔抗 CHO HCPs 多抗作為檢測(cè)抗體，并建立了夾心 ELISA 檢測(cè)法；該方法不受原液基質(zhì)干擾，HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品在 3.33 ～ 810 ng/ml 濃度范圍曲線擬合良好，原液在 1 ～ 8 倍范圍內(nèi)有良好的稀釋線性；檢測(cè)限 0.075 ng/ml，定量限 20 ng/ml；試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間變異系數(shù)均不超過 10%；30、150 及 300 ng/ml 濃度的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率分別為 107%、107% 和 95%；工藝特異性 ELISA法測(cè)得的結(jié)果顯著高于商業(yè)化通用檢測(cè)方法。建立了重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs ELISA 檢測(cè)方法，該方法具有良好的檢出率、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性和線性，適用于該制品 HCPs 殘留檢測(cè)。

重組抗 VEGF 單抗； CHO 細(xì)胞； 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)； 酶聯(lián)免疫吸附法

宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（host cell proteins，HCPs）是由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或編碼的與預(yù)期目標(biāo)藥物無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)，其組成復(fù)雜，主要與宿主表達(dá)系統(tǒng)和活性成分的表達(dá)方式有關(guān)[1]。由于 HCPs 來(lái)源于非人表達(dá)系統(tǒng)，其外來(lái)或“非自身”的特性決定幾乎任何單個(gè) HCP 都有可能在人體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)[2]。HCPs 在人體內(nèi)的不良反應(yīng)包括：誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗 HCPs 抗體，從而引起過敏反應(yīng)，或發(fā)揮“佐劑效應(yīng)”誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗藥抗體[3-4]；有些來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 HCPs 具有生物學(xué)活性，可能在人體內(nèi)發(fā)揮作用（如細(xì)胞因子和趨化因子家族）[5]，從而影響藥物的安全性和有效性；HCPs 中的蛋白酶還會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 HCPs 組成，從而影響后續(xù)純化工藝對(duì) HCPs 的清除[4, 6]；另外 HCPs 的蛋白酶活性會(huì)降解藥物蛋白或促進(jìn)蛋白制劑中的聚山梨酯降解而影響藥物蛋白的穩(wěn)定性[2, 7-8]。鑒于 HCPs 對(duì)患者的安全性和產(chǎn)品的有效性的潛在影響，在純化工藝中必須對(duì) HCPs 進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，有效去除 HCPs，并保持工藝的穩(wěn)健性。

目前 HCPs 分析和檢測(cè)的主要方法有一維電泳（1D SDS-PAGE）或二維電泳法（2D SDS-PAGE）、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等[6, 9-10]。不同的分析方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，其中 ELISA 法因高特異性、高靈敏度、數(shù)據(jù)定量及通量高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于重組生物制品的質(zhì)量控制[1, 9]?？?HCPs 多克隆抗體和 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品是 ELISA 法的關(guān)鍵試劑，該多抗對(duì)重組生物制品中 HCPs 的識(shí)別能力可直接影響 HCPs 的測(cè)定結(jié)果；因此，需對(duì)檢測(cè)用 HCPs 多抗識(shí)別 HCPs 的能力（一般稱為覆蓋率）進(jìn)行分析[9, 11]；理想的多克隆抗體應(yīng)能識(shí)別大部分 HCPs 蛋白[11]。

本研究采用 2D SDS-PAGE/Western blot 法對(duì) 6 種抗 CHO HCPs 多抗識(shí)別重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進(jìn)行分析測(cè)定，并挑選覆蓋率最高的一種多抗作為檢測(cè)用抗體，建立測(cè)定該單抗制品中殘留 HCPs 的夾心 ELISA 法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與樣品 CHO-K1 細(xì)胞（含空載質(zhì)粒）及重組人抗 VEGF 單抗原液均由百奧泰生物制藥股份有限公司制備和保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 兔抗 CHO HCPs 多抗（編號(hào)：C3, C6, C7, AB000103-A, AB000103-C）為美國(guó)ArrayBridge 公司專有產(chǎn)品；生物素標(biāo)記的兔抗 CHO HCPs 多抗（編號(hào)：C6-Biotin）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素及 TMB 底物溶液購(gòu)自淄博云橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗 CHO HCPs 多抗（編號(hào)：3G-0016-AF）和 HCPs ELISA 試劑盒（F550）均購(gòu)自美國(guó) Cygnus 公司；熒光染料 Sypro Ruby Protein Blot Stain 購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific公司；IRDye 800CW 標(biāo)記的驢抗山羊 IgG 復(fù)合物和 IRDye 800CW 標(biāo)記的驢抗兔 IgG 復(fù)合物均購(gòu)自美國(guó) Li-COR 公司；ETTAN IPGphor 3 等電聚焦儀和 ETTAN DALTsix 電泳槽為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品；ScanMaker i800 掃描儀為上海中晶科技有限公司產(chǎn)品；PROTEAN i12TMIEF Cell 等電聚焦儀、Mini-PROTEAN Tetra System 電泳槽及 ChemiDoc 成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；SpectraMax M4 酶標(biāo)儀為美國(guó) Molecular Device 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 工藝特異性 HCPs 的制備 參照文獻(xiàn)[11-12]，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的 CHO-K1 細(xì)胞采用相同的生產(chǎn)培養(yǎng)基模擬重組人抗 VEGF 單抗上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝制備細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)超濾濃縮置換緩沖液后獲得上游工藝特異性 HCPs，經(jīng) BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，作為建立 ELISA 法的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 工藝特異性 HCPs 的二維電泳表征 HCPs標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)丙酮沉淀處理后，用 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。第一維等電聚焦電泳的 HCPs 上樣量 300 μg，采用 17 cm/pH 3 ～ 10 干膠條在 ETTANIPGphor 3 等電聚焦儀上先進(jìn)行等電聚焦分離；第二維 SDS-PAGE 采用 12.5% 分離膠，在 ETTAN DALTsix 電泳槽上進(jìn)行分離；銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，而后對(duì)凝膠進(jìn)行掃描與拍照；采用 GE Image Master 2D platinum 5.0 分析軟件對(duì)凝膠上的斑點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 HCPs 多抗識(shí)別 HCPs 的覆蓋率分析 第一維等電聚焦電泳的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品上樣量 1 mg，采用 18 cm/pH 3 ～ 10 干膠條在 PROTEAN i12TMIEF Cell 等電聚焦儀上先進(jìn)行等電聚焦分離；第二維 SDS-PAGE 采用 4% ～ 20% 梯度分離膠，在 Mini-PROTEAN 電泳槽上進(jìn)行分離；采用熒光染料 Sypro Ruby 對(duì)凝膠進(jìn)行總蛋白質(zhì)染色后，ChemiDoc 成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行曝光拍照或?qū)δz進(jìn)行轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜后，1% 牛血清白蛋白（BSA）于室溫下封閉 2 h；分別加入 5 種兔抗 CHO HCPs 多抗（稀釋終濃度為 2.7 μg/ml）及山羊抗 CHO HCPs 多抗（稀釋終濃度為 0.53 μg/ml），室溫孵育 90 min；洗滌后加入 IRDye 800CW 標(biāo)記的驢抗兔 IgG 復(fù)合物（1:5000 稀釋）或 IRDye 800CW 標(biāo)記的驢抗山羊 IgG 復(fù)合物（1:5000 稀釋），室溫孵育 60 min，洗滌后，采用 Li-Cor Odyssey 紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照；凝膠圖片及 2D SDS-PAGE/Western blot 圖片采用 Bio-Rad PDQuest 雙向電泳圖像分析軟件進(jìn)行分析，軟件自動(dòng)識(shí)別并統(tǒng)計(jì)圖譜上的斑點(diǎn)數(shù)目，計(jì)算不同 CHO HCPs 多克隆抗體識(shí)別 HCPs 的覆蓋率，選擇覆蓋率最高的多抗作為檢測(cè)抗體。

1.2.4 ELISA 方法的建立 以 1.2.3 項(xiàng)篩選得到的兔抗 CHOHCPs 多抗作為包被檢測(cè)抗體，以5 μg/ml 包被酶標(biāo)板，1% BSA 封閉后，以 100 μl/孔加入 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，室溫反應(yīng) 1.5 h；洗滌 3 次，100 μl/孔加入終濃度為 1.25 μg/ml 的生物素標(biāo)記的兔抗 CHO HCPs 多抗，室溫反應(yīng)50 min；洗滌 3 次，100 μl/孔加入終濃度為 0.1 μg/ml 的 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫反應(yīng) 0.5 h；洗滌 3 次，100 μl/孔加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液，室溫下孵育 5 min；100 μl/孔加入終止液。酶標(biāo)儀在 450 nm 處測(cè)定吸光度（A）；以不同濃度 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中宿主細(xì)胞蛋白含量。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.5.1 線性與范圍 在用兔抗 CHOHCPs 多抗包被的酶標(biāo)板中以 100 μl/孔，分別加入 0、3.33、10、30、90、270 和 810 ng/ml的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品，按 1.2.4 項(xiàng)進(jìn)行操作并繪制四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 基質(zhì)干擾 取原液樣品，按 3:1 的比例加入 600 ng/ml HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品；以相同比例在原液中加入 0 ng/ml HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液作為空白對(duì)照，按照 1.2.4 項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，扣除原液基質(zhì)的 HCPs，計(jì)算 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率；回收率若處于 80% ～ 120% 則表明原液基質(zhì)不干擾 HCPs 檢測(cè)；否則存在干擾，原液需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.3 樣品稀釋線性 將原液樣品分別稀釋 1、2、4、8 倍后按照 1.2.4 項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算4 個(gè)稀釋度的 HCPs 檢測(cè)結(jié)果；同時(shí)計(jì)算相鄰兩個(gè)稀釋度所測(cè)結(jié)果之間的百分比。

1.2.5.5 精密度 同一名分析人員對(duì)低、中、高（分別為25、150、600 ng/ml）濃度的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品，在同一次試驗(yàn)內(nèi)每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定 3 份，計(jì)算CV，即為試驗(yàn)內(nèi)精密度；兩名分析人員分別對(duì)上述 3 個(gè)濃度的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算CV，即為不同人員試驗(yàn)之間精密度。

1.2.5.6 準(zhǔn)確性 將原液樣品分別與 60、300 和 600 ng/ml HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合，另設(shè)添加等體積 0 ng/ml HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的原液樣品混合液作為空白對(duì)照，重復(fù)檢測(cè) 3 次，測(cè)定混合樣品的 HCPs 含量，扣除空白后，計(jì)算 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率及CV。

1.2.6 工藝特異性和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 方法橋接 采用 1.2.4 項(xiàng)建立的工藝特異性 HCPs ELISA 方法和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 試劑盒同時(shí)對(duì) 5 批原液樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 工藝特異性HCPs 的二維電泳表征

二維電泳銀染圖譜顯示，制備的工藝特異性 HCPs 中含有大量蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)從 3 ～ 10，分子量從 10 ～ 180 kD 范圍內(nèi)均有分布；經(jīng)分析統(tǒng)計(jì)共識(shí)別出 863 個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（圖 1），表明制備的工藝特異性 HCPs 蛋白質(zhì)譜廣泛，可用作 HCPs 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品。

圖 1 工藝特異性 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的二維電泳銀染圖

Figure 1 2D SDS-PAGE of process-specific HCPs stained with silver

圖 2 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的四參數(shù)擬合曲線

Figure 2 Fitting curve of HCPs standard with four parameter logistic model

2.2 HCPs 多抗識(shí)別HCPs 的覆蓋率

分析結(jié)果顯示，5 種編號(hào)分別為 C3、C6、C9、AB000103-A 和 AB000103-C 的兔抗 CHO HCPs 多抗識(shí)別工藝特異性 HCPs 的覆蓋率分別為 24%、59%、57%、32% 和 34%；編號(hào)為 3G-0016-AF 的山羊抗 CHO HCPs 多抗覆蓋率則為 28%；其中編號(hào) C6 多抗的覆蓋率最高，接近 60%，故選擇該多抗作為檢測(cè)抗體。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性與范圍 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品在 3.33 ～810 ng/ml 范圍與450值的四參數(shù)曲線方程為 y =（0.11 – 7.2）/［1 +（/ 1427^0.991）］+ 7.2，2= 1，具有良好的曲線擬合，見圖 2。

2.3.2 基質(zhì)干擾 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的理論值為150 ng/ml，實(shí)際測(cè)定值為 136 ng/ml，回收率 91%，表明原液樣品基質(zhì)對(duì) HCPs 測(cè)定沒有干擾。

2.3.3 樣品稀釋線性 原液樣品稀釋 1、2、4、8 倍后測(cè)得的 HCPs 結(jié)果如表 1 所示。結(jié)果表明，樣品稀釋 1 ～ 8 倍時(shí)，相鄰兩個(gè)稀釋度所測(cè)結(jié)果之間的百分比在 80% ～ 120% 之間，原液樣品稀釋1 ～ 8 倍存在稀釋線性。

2.3.4 靈敏度 經(jīng)檢測(cè)與計(jì)算，方法的檢測(cè)限為 0.075 ng/ml。10 ng/ml、15 ng/ml 和 20 ng/ml 的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品和原液樣品混合的加標(biāo)回收率分別為 16.8%、67.3% 和 74.4%，CV分別為 2.6%、3.2% 和 2.3%，因此該方法的定量限為 20 ng/ml。

2.3.5 精密度 低、中、高三個(gè)濃度 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)內(nèi)CV 分別為 1.1%、9.2% 和 3.8%；試驗(yàn)間 CV 分別為 5.0%、8.1% 和 3.9%；方法的精密度良好，見表 2。

2.3.6 準(zhǔn)確性 低、中、高三個(gè)濃度 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的回收率分別為 107%、107% 和 95%；CV 分別為18.4%、10.0% 和 9.4%，見表 3；方法的準(zhǔn)確性良好。

表 1 原液稀釋線性

2.4 工藝特異性和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 方法橋接

表 4 結(jié)果顯示，工藝特異性 HCPs ELISA 方法測(cè)定 5 批原液的 HCPs 殘留結(jié)果在 10 ～ 20 ppm范圍內(nèi)，顯著高于商業(yè)化通用 ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)得的結(jié)果（0.8 ～ 1.6 ppm）。

3 討論

由于 HCPs 對(duì)重組生物制品的質(zhì)量、療效以及患者安全的潛在影響，同時(shí) HCPs 的監(jiān)測(cè)是下游純化工藝開發(fā)的一個(gè)重要指標(biāo)，因此重組生物治療產(chǎn)品中殘留 HCPs 的含量通常被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），一般需要納入生產(chǎn)過程控制及原液批放行檢測(cè)[1, 4]。重組生物制品終產(chǎn)品中 HCPs 應(yīng)控制在一個(gè)可接受的低水平，一般行業(yè)共識(shí)和監(jiān)管部門要求是不超過 100 ppm[1, 4]。HCPs 組成成分復(fù)雜和多樣且受到多個(gè)因素的影響，比如與宿主表達(dá)系統(tǒng)、目標(biāo)蛋白的表達(dá)方式、細(xì)胞培養(yǎng)和下游純化工藝等因素有關(guān)[1, 3, 13]，這些都給 HCPs 的檢測(cè)和控制帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。檢測(cè) HCPs 的方法較多，但夾心 ELISA 法因獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，仍然是目前 HCPs 檢測(cè)使用最廣泛的方法。大多數(shù)生物制藥公司在產(chǎn)品開發(fā)早期階段通常采用商業(yè)化通用HCPs ELISA 試劑盒對(duì)下游純化過程中間產(chǎn)物及原液中的 HCPs 進(jìn)行檢測(cè)和控制，但商業(yè)化 ELISA 試劑盒使用的 HCPs 標(biāo)準(zhǔn)品往往與特定產(chǎn)品的 HCPs 種類存在較大差異，且商業(yè)化 ELISA 試劑盒使用的 HCPs 多抗可能未必適用于特定產(chǎn)品；因此，一般在產(chǎn)品開發(fā)的后期（如 III 期臨床或工藝驗(yàn)證前）需要開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性 ELISA 檢測(cè)方法[13]。目前部分已上市重組生物制品的研發(fā)單位通過開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA 檢測(cè)方法來(lái)解決商業(yè)化試劑盒的不足，但產(chǎn)品工藝特異性的檢測(cè)方法開發(fā)周期較長(zhǎng)、成本高昂，且有研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA 檢測(cè)方法也不能保證回收率優(yōu)于商業(yè)化 ELISA 試劑盒[3, 14]。有研究建議，在 HCPs 抗體覆蓋率達(dá)到一定水平時(shí)，通過開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性標(biāo)準(zhǔn)品，建立產(chǎn)品特異性 ELISA 檢測(cè)法可能是一種較好的解決方案[3, 9]。無(wú)論采用產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA檢測(cè)方法還是商業(yè)化檢測(cè)試劑盒，都需預(yù)先對(duì)所使用的 HCPs 抗體識(shí)別 HCPs 的能力（覆蓋率）進(jìn)行分析[11]。

表 2 精密度驗(yàn)證

表 4 工藝特異性和商業(yè)化 ELISA 方法檢測(cè)原液中 HCPs 殘留的結(jié)果（ppm）

研究首先制備了上游工藝特異性 HCPs，經(jīng)二維電泳分析顯示 HCP 蛋白譜分布廣泛；而后采用 2D SDS-PAGE/Western blot 法對(duì) 6 種抗 CHO HCPs 多抗識(shí)別重組抗VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進(jìn)行檢測(cè)分析，篩選到覆蓋率達(dá) 59% 的 C6 多抗（經(jīng)重復(fù)分析覆蓋率為 69%）作為檢測(cè)抗體，建立了產(chǎn)品工藝特異性 HCPs 夾心 ELISA 檢測(cè)法。驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法的 LOD 和 LOQ 分別為 0.075和 20 ng/ml；試驗(yàn)內(nèi)、試驗(yàn)間精密度及準(zhǔn)確性均符合要求；方法的測(cè)定范圍為 20 ～ 810 ng/ml；原液基質(zhì)對(duì)測(cè)定沒有干擾。此外，由于重組抗 VEGF 單抗早期臨床開發(fā)階段采用的是商業(yè)化通用 ELISA 檢測(cè)試劑盒，因此采用本研究建立的工藝特異性 HCPs ELISA 檢測(cè)法與早期通用檢測(cè)方法進(jìn)行了橋接對(duì)比研究，結(jié)果顯示工藝特異性檢測(cè)方法獲得的結(jié)果顯著高于通用檢測(cè)方法，這也與該通用檢測(cè)試劑盒所使用的 HCPs 多抗（編號(hào) 3G-0016-PA）覆蓋率低相印證。

本研究成功建立了重組抗 VEGF 單抗殘留 HCPs 的 ELISA 檢測(cè)方法，該方法具有良好的檢出率、靈敏度、準(zhǔn)確性、精密度和線性，可用于該產(chǎn)品中 HCPs 殘留的檢測(cè)。本方法比從頭開發(fā)一個(gè)新的產(chǎn)品或工藝特異性 ELISA 檢測(cè)方法節(jié)省幾個(gè)月的時(shí)間，同時(shí)又可以提供比較高的抗體覆蓋率以滿足藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求。此研究也為其他重組生物制品的殘留 HCPs 檢測(cè)方法的開發(fā)提供參考。

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Development and validation of a process-specific ELISA assay for detection of residual host cell proteins in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody

DENG Chun-ping, MEI Xiong, WANG Xing, LIU Cui-hua

Bio-Thera Solutions, Ltd., Guangzhou 519085, China (DENG Chun-ping, MEI Xiong, LIU Cui-hua); ArrayBridge Inc., St. Louis, 63110, USA (WANG Xing)

To develop and validate an ELISA assay for testing residual CHO host cell proteins (HCPs) in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody.The process-specific HCPs were prepared using mock-transfected null CHO cells and then characterized by 2D-SDS PAGE. The coverage of the process-specific HCPs population of recombinant anti-VEGF monoclonal antibody recognized by six anti-CHO HCPs polyclonal antibodies (C3, C6, C7, AB000103-A, AB000103-C, 3G-0016-AF) was evaluated by two-dimensional electrophoresis coupled with Western blot (2D SDS-PAGE/Western blot). The polyclonal antibody with the highest coverage was chosen as a testing antibody, based on which the process-specific ELISA for the measurement of residual HCPs in products was developed and validated with respect to the linearity, matrix interference, dilution linearity, sensitivity, precision and accuracy. In addition, a bridging comparison study was performed between the established process-specific ELISA and commercial generic detection method.The process-specific HCPs showed a broad spectrum of proteins. Rabbit anti-CHO HCPs polyclonal antibodies (C6) with coverage of 59% was screened as a testing antibody, and a sandwich ELISA was accordingly established. The ELISA method was not interfered by drug substance matrix; the curve of HCPs standard fit well in the range of 3.33 - 810 ng/ml; the drug substance showed a good dilution linearity in the range of 1 - 8. The limit of detection and quantitative of the method was 0.075 ng/ml and 20 ng/ml, respectively, both the CVs in intra- and inter-assays were less than 10%, while the recovery of HCPs standard at 30, 150 and 300 ng/ml was 107%, 107% and 95%, respectively. The results obtained by process-specific ELISA from drug substance were significantly higher than those obtained by commercial generic detection method.A process-specific ELISA method has been successfully established, which shows appropriate coverage, sensitivity, accuracy, precision and linearity, and is suitable for detection of the residual HCPs in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody.

recombinant anti-VEGF monoclonal antibody; CHO cells; host cell proteins; ELISA

LIU Cui-hua, Email: chliu@bio-thera.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.004

“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2013ZX09401001）；廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（2013Y116）

劉翠華，Email：chliu@bio-thera.com

2021-04-12