高效根結線蟲生防真菌篩選及其性能研究

李 磊， 趙俊杰， 劉瑩瑩， 甄 靜， 李亮亮， 陳國參， 慕 琦， 王繼雯

(1. 河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450000；2. 河南省科學院生物研究所有限責任公司，鄭州 450000)

根結線蟲屬于線蟲門、側尾腺綱、墊刃目、異皮科、根結線蟲屬[1]，其主要危害作物的根部，能侵染根部細胞，使根部輸導組織遭到破壞，從而失去吸收養(yǎng)分和水分的能力，導致作物營養(yǎng)不良而早衰，甚至整株干枯死亡。1885年，Berkeley最先[2]在黃瓜根際發(fā)現(xiàn)根結線蟲，此后不斷有新種被發(fā)現(xiàn)。約有80多種根結線蟲種類被報道[3]，而我國記錄的有效種有39個[4]。蔬菜根結線蟲寄生范圍廣、繁殖速度快、侵染具有掩蔽性且能通過病土、病苗和灌水等方式傳播[5-6]，防治比較困難，給蔬菜生產(chǎn)造成巨大的損失，因此對根結線蟲的防治已經(jīng)成為一項非常重要的農業(yè)生產(chǎn)任務。

已有的根結線蟲病害的防治措施主要包括化學防治、物理防治、農業(yè)防治、抗病育種和生物防治等[7]。生物防治是近年來新興起的一種防治方法，生物防治所篩選的目標拮抗物均來源于自然環(huán)境中，對土壤環(huán)境友好，不污染環(huán)境，綠色環(huán)保，具有可持續(xù)性，符合綠色農業(yè)的發(fā)展要求，是一種比較理想的防治技術[8]。

生物防治蔬菜根結線蟲病害的前提是獲得具有生防作用的菌株，而如何高效地篩選出生防菌株是最為關鍵的問題[9]。馬金慧等[10]研究表明哈茨木霉菌株TRI2發(fā)酵液在48 h時可以100%殺死根結線蟲，Zhang等[11]研究表明長枝木霉菌株T6對南方根結線蟲的二齡幼蟲具有較強的寄生和致死作用。Bokhari等[12]的研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉、康寧木霉、綠色木霉和鉤狀木霉均有防治爪哇根結線蟲的活性。翟明娟等[13]研究表明綠色木霉菌株Tvir-6發(fā)酵液在24 h內對根結線蟲二齡幼蟲的校正死亡率高達98.5%，Burgwyn等[14]研究表明哈茨木霉和綠色木霉發(fā)酵濾液均能顯著降低南方根結線蟲卵的孵化和二齡幼蟲的活性。卵是根結線蟲生活史中的一個重要階段，也是真菌防治作用最敏感的一個時期[15]。根結線蟲的外殼有脂質層、幾丁質層和卵黃層組成，其中幾丁質的含量約占整個卵殼成分的40%[16-17]。在根結線蟲卵殼中幾丁質層結構堅固是防止真菌侵染的重要屏障[18]。真菌寄生根結線蟲蟲卵是在細胞機械壓力和酶類共同作用下完成的,高活性的幾丁質酶可以軟化根結線蟲卵殼降低其卵殼通透性有利于真菌菌絲對卵殼的穿透[19]。因此，幾丁質酶的活性是評價真菌生防潛力的重要指標。目前對棘孢木霉的研究多集中在其對尖孢鐮刀菌[20]和葉枯病菌[21]等病原菌的防治作用上，關于棘孢木霉對根結線蟲有生防作用卻未見報道。本研究以產(chǎn)幾丁質酶活性和離體拮抗試驗為篩選指標，建立一種有效的體系，能夠篩選出具有防治根結線蟲潛力的生防菌株，獲得能夠實際應用于蔬菜生產(chǎn)中防治根結線蟲的有效菌種資源，為蔬菜根結線蟲生防菌劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2018年6月于安陽滑縣根結線蟲病害發(fā)病的蔬菜大棚中采集了番茄根際土樣和根結組織樣品，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，蛋白胨5 g，硫酸鎂0.5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，孟加拉紅水溶液3 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。臨用前，每100 mL培養(yǎng)基加入1%鏈霉素0.3 mL。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加入蒸餾水煮沸30 min，用紗布過濾，向濾液中加入蔗糖20 g，瓊脂20 g，補蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基：蔗糖3 g，硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.5 g，硫酸鎂0.5 g，加入膠體幾丁質2 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加入蒸餾水煮沸30 min，用紗布過濾，向濾液中加入蔗糖20 g，補蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

測定培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，蔗糖3 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.5 g，硫酸鎂0.5 g，加入膠體幾丁質2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加入蒸餾水煮沸30 min，用紗布過濾，向濾液中加入蔗糖20 g，補蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株分離純化

稱取根際土樣10 g，溶于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，搖床振蕩10 min，搖勻即為10-1稀釋液，將樣品依次稀釋至10-4，分別涂布于分離培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑取單菌落，純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

用自來水將根結組織上的泥土沖洗干凈，用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次，用已滅菌的剪刀將根組織剪成0.5 cm長的小段，用滅菌的鑷子夾取3～5段根組織接于分離培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待根組織周圍長出菌絲體，純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 幾丁質平板透明圈法初篩

選取菌絲體生長良好的菌株平板，用打孔器打孔，得到直徑為5 mm的菌塊，將菌塊接于篩選培養(yǎng)基上，每個篩選培養(yǎng)基上接3個菌塊，每個處理重復3次，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察菌塊周圍是否出現(xiàn)水解透明圈，測量透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)。

1.2.3 幾丁質酶活的測定

將初篩選出的菌株接于種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，25 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h后，按0.5%接種量接入測定培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，25 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液用濾紙過濾。取10 mL離心管兩支，分別加入1 mL濾液和1 mL含量為1%幾丁質膠體，一支離心管于4 ℃放置作為對照，另一支離心管于40 ℃水浴60 min，水浴結束后，在樣品和對照中均加入1 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷卻室溫后，加入2 mL蒸餾水，4 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm波長下測定吸光度值，每個處理重復3次。根據(jù)N-乙?；?D-氨基葡萄糖標準曲線計算還原糖含量。酶活力單位定義：在上述條件下，1 min催化底物生產(chǎn)1 μmol N-乙?；?D-氨基葡萄糖所需要的酶量作為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 菌株鑒定

真菌菌株的鑒定綜合其形態(tài)學特征與rDNA-ITS(Internal Transcribed Spacer)序列分子鑒定結果。其中真菌形態(tài)學的鑒定參照《真菌鑒定手冊》，將真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落的顏色、菌絲形態(tài)、生長速率等特征，同時采用顯微鏡觀察其孢子的形態(tài)特征。

分子生物學鑒定采用真菌試劑盒提取菌體總DNA。以提取的總DNA為模板，利用ITS通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT TAT TGATATGC-3′)擴增供試菌的片段。PCR體系為50 μL體系：DNA模板2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶1 μL，dd H2O 34 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次；72 ℃再延伸10 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后進行測序分析。測序結果使用NCBI中(National Center Forbiotechnology Information)的GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對。選取同源性較高的模式菌株的ITS序列，采用mega 5.0軟件中的鄰接(neighbor joining，NJ)法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5 菌株對根結線蟲蟲卵的寄生試驗

將初篩選出的菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，使菌絲長滿整個平板。用無菌水沖洗長滿菌絲體的平板，經(jīng)無菌濾布過濾，收集得到孢子懸液。采用血球計數(shù)板計數(shù)，調整孢子懸液濃度為1×107CFU/mL。將病根洗凈，在解剖鏡下直接挑取新鮮的卵塊，用1%次氯酸鈉震蕩解離卵塊，收集游離卵，經(jīng)2%次氯酸鈉表面消毒后無菌水沖洗，制成100個卵/mL的懸浮液。取無菌12孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種1 mL孢子懸液和1 mL卵懸液。每個處理重復3次。以加無菌水作為對照。在pH自然溫度為25 ℃條件下，培養(yǎng)7 d后，觀察卵的寄生情況，并計算卵的寄生率。計算公式：卵寄生率=(被寄生卵數(shù)/加入卵總數(shù))×100%。

1.2.6 菌株對根結線蟲蟲卵孵化的抑制作用

將篩選出的菌株接入種子液培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，在pH自然，25 ℃條件下，180 r/min培養(yǎng)48 h后，按0.5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，在25 ℃條件下，180 r/min培養(yǎng)72 h后，獲得發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，經(jīng)濾膜孔徑為0.22 μm過濾器過濾得到上清液。取無菌12孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種1 mL發(fā)酵上清液和1 mL卵懸液。每個處理重復3次。以空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照。在25 ℃條件下，分別培養(yǎng)1、3、5、7和9 d后，觀察卵的孵化情況，并計算卵孵化的相對抑制率。計算公式：相對抑制率=(對照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù))/對照孵化線蟲數(shù)×100%。

1.2.7 菌株對二齡幼蟲的致死作用

從洗凈的病根上直接挑取新鮮的卵塊于孵化裝置中進行孵化，24 h后開始收集幼蟲，制備濃度為100 條/mL幼蟲懸液。真菌發(fā)酵液的制備方法與上述1.2.5相同。取無菌12孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種1 mL發(fā)酵上清液和1 mL幼蟲懸液。每個處理重復3次。以空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照。在pH自然，25 ℃條件下，分別培養(yǎng)12、24、36、48和60 h后，觀察二齡幼蟲的致死情況，線蟲僵直不動并用挑針觸動不動者為死蟲，線蟲呈彎曲蠕動狀態(tài)或挑針觸動后活動者為活蟲。計算公式：致死率=(幼蟲死亡數(shù)/幼蟲總數(shù))×100%；校正致死率=[(處理線蟲致死率-對照線蟲致死率)/(1-對照線蟲致死率)]×100%。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理，采用DPS 7.05進行數(shù)據(jù)分析，樣品與樣品組之間用單因素方差分析中的圖基(Tukey)檢驗進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 幾丁質平板透明圈初篩結果

從采集的根際土樣和根結組織上共分離獲得真菌168株。測定其在幾丁質平板上形成透明圈直徑值 (D)和菌落直徑值(d)，得到10株具有較高產(chǎn)幾丁質酶活潛力的菌株，結果見表1，10株菌株的D/d值均高于2，菌株SFC-3的D/d值最高。

表1 菌株透明圈測定結果

2.2 幾丁質酶活的測定

對初篩得到的10株菌株，培養(yǎng)48 h后的幾丁質酶活進行測定。結果(圖1)顯示，10株菌株的幾丁質酶活均大于1 U/mL，與測定透明圈直徑/菌落直徑的值(D/d)結果相一致，D/d值較高的菌株，幾丁質酶活值也較高。其中酶活性最高的菌株為SFC-3，其酶活為2.07 U/mL。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 不同菌株幾丁質酶活Figure 1 Chitinase activity in different strains

2.3 菌株鑒定結果

菌株SFC-3在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初期為白色，中心淺綠色，氣生菌絲纖細、羊毛狀，由中心向四周散布，菌落背面無色，菌落中期逐漸轉變?yōu)闇\綠色，中心呈深綠色[圖2(a)]，氣生菌絲轉變?yōu)槊扌鯛?，菌落后期整體呈深綠色，在顯微鏡下觀察其分生孢子為綠色，形狀呈球形或橢球型，直徑約為3 μm[圖2(b)]。根據(jù)《真菌鑒定手冊》初步判斷菌株SFC-3為木霉屬。將菌株SFC-3 的ITS序列的測定結果在GenBank上進行Blast比對分析，選取與其相近的模式菌株構建進化樹，結果如圖3所示。在進化樹中，菌株SFC-3與棘孢木霉(Trichodermaasperellum)有最高相似度，同源性達到了99%。結合其形態(tài)學特征，鑒定菌株SFC-3為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。

圖2 SFC-3在PDA平板上形成的菌落(a)及顯微鏡下的孢子的形態(tài)特征(b)Figure 2 Morphological characteristics of colonies(a)and spores under microscope of SFC-3 on PDA plates(b)

圖3 基于ITS rDNA序列菌株SFC-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of strain SFC-3 based on ITS rDNA sequences

2.4 不同菌株對根結線蟲蟲卵的寄生結果

不同菌株對根結線蟲卵的寄生結果如圖4所示。菌株對蟲卵的寄生率與其產(chǎn)幾丁質酶活(表1)的值呈正相關，產(chǎn)酶活能力越強，對蟲卵的寄生率越高，其中寄生率最低的菌株為SFC-1，寄生率為41.29%；寄生率最高的菌株為SFC-3，其寄生率達到了78.86%，與其他菌株相比差異極顯著(P<0.01)；其余8個菌株的寄生率為43%～75%。菌株SFC-3對卵的寄生作用如圖5所示，對照組中的蟲卵其表面光滑，內容物均勻[圖5(a)]，菌株SFC-3處理組中被寄生的卵長滿菌絲體 [圖5(b)]。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 不同菌株對蟲卵的寄生結果Figure 4 Parasitic results of different strains on eggs

(a)對照CK;(b) 菌株SFC-3處理。圖5 菌株SFC-3對蟲卵的寄生作用Figure 5 The parasitic effect of the strain SFC-3 on the eggs

2.5 菌株對根結線蟲蟲卵孵化的抑制作用

菌株SFC-3發(fā)酵濾液對根結線蟲卵孵化的影響如圖6所示：在第1 天菌株SFC-3發(fā)酵濾液對根結線蟲卵孵化抑制率就達到了85%以上；第3 天，發(fā)酵液對蟲卵的抑制率達到了90.81%；在第7天菌株SFC-3發(fā)酵濾液對線蟲卵孵化抑制率最高達96.51%。這說明菌株SFC-3對根結線蟲蟲卵孵化有良好的抑制效果。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖6 菌株SFC-3對線蟲卵孵化的相對抑制率Figure 6 Relative inhibition rate of the strain SFC-3 on hatching of nematode eggs

2.6 菌株對二齡幼蟲的致死作用

菌株SFC-3對二齡幼蟲的致死作用如圖7所示，隨著時間增加，菌株對二齡幼蟲的校正致死率隨之增長，在24 h達到了85.64%，在48 h達到最高點93.37%。這表明菌株SFC-3在防治根結線蟲蟲害中有良好的潛力。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖7 菌株SFC-3對二齡幼蟲的校正致死率Figure 7 Corrected mortality of the strain SFC-3 against the second juveniles

3 討論與結論

根結線蟲的生活史是從蟲卵到四齡成蟲，在整個階段中卵的孵化至二齡幼蟲的形成階段是暴露在根外土壤中的，其余階段都是寄生在根組織中，因此從線蟲卵孵化到二齡幼蟲的形成是防治根結線蟲的重要時期。研究表明:利用SFC-3發(fā)酵濾液作用根結線蟲卵第1 天就對卵孵化抑制率達到了85%以上，因此，可以從蟲卵孵化第1 天開始使用菌株SFC-3發(fā)酵濾液來抑制蟲卵孵化，不但對根結線蟲防治效果較好，而且可以有效節(jié)約防治時間和生產(chǎn)成本。菌株殺死蟲卵主要是通過寄生作用，卵囊外層為膠質，真菌菌絲可以進行穿透，加上真菌在生長過程中的一些分泌物及代謝產(chǎn)物如蛋白酶類，水解酶類會破壞卵的結構影響其正常的發(fā)育從而殺死蟲卵；菌株殺死二齡幼蟲則主要靠其高活性的幾丁質酶溶解二齡幼蟲外殼致其死亡。從機理和抑制效果來看，該菌株在對蟲卵的致死效果要優(yōu)于對二齡幼蟲的致死效果。

研究從番茄根際土壤篩選到一株高效抗蔬菜根結線蟲的菌株SFC-3，經(jīng)鑒定為棘孢木霉。在實驗室條件下，通過根結線蟲蟲卵寄生實驗和二齡幼蟲致死率實驗發(fā)現(xiàn)：菌株SFC-3對蟲卵的寄生率最高達78.86%，對根結線蟲蟲卵孵化的相對抑制率最高達96.51%，對二齡幼蟲的校正死亡率達到93.37%。因此，菌株SFC-3是一株具有潛力的抗根結線蟲菌株。