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    基于matK部分序列福建茶樹(shù)遺傳多樣性分析

    2021-12-20 11:49:04聶傳朋陳丹丹李焰焰
    生物學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:政和福安茶樹(shù)

    聶傳朋, 陳丹丹, 李焰焰

    (武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院,武夷山 354300)

    福建有悠久的茶樹(shù)種植歷史,經(jīng)過(guò)不斷的雜交和自交,茶樹(shù)資源豐富[1]。但也因?yàn)椴粩嗟淖越缓碗s交,這些茶樹(shù)骨干親本相似,親緣關(guān)系密切,遺傳背景較窄[2]。DNA條形碼在系統(tǒng)分類學(xué)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。利用特定的DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析植物的系統(tǒng)發(fā)生和遺傳變異,為物種鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了重要依據(jù)[3]。matK基因是DNA條形碼識(shí)別的核心序列,廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育和遺傳結(jié)構(gòu)分析[4]。matK基因引物通用性差,研究在前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)成功的前提下,通過(guò)matK部分序列對(duì)采自武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃(始建于2015年,面積80畝約5.33 km2)引種于福建省5個(gè)地區(qū)的51個(gè)茶樹(shù)品種樣本遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,了解資源圃內(nèi)福建茶樹(shù)的遺傳背景,為武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃建設(shè)及福建茶樹(shù)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

    51個(gè)茶樹(shù)品種樣本均采集武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃,按照原產(chǎn)地分成5個(gè)群體(表1)。還有原產(chǎn)自建陽(yáng)和永春的茶樹(shù)資源各1種。將新鮮采摘的福建茶種放在密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室,用其嫩葉提取DNA。將嫩葉洗凈晾干后,放入冰凍過(guò)的研缽中,經(jīng)液氮研磨,至粉末狀后將轉(zhuǎn)移到離心管中[5]。

    1.2 茶樹(shù)DNA提取

    選擇Plant Genomic DNA試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)對(duì)新鮮采摘的51個(gè)福建茶種提取總DNA[6]。所有離心步驟均使用臺(tái)式高速離心機(jī),在室溫下進(jìn)行離心。提取的總DNA, 采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[7]。將收集的DNA溶液置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

    表1 福建茶樹(shù)品種及單倍型信息表

    1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

    PCR擴(kuò)增引物為matKKIM_3F(5′-CGTACAGTCTTTTGTGTTTACGAG-3′)和matKKIM 1R(5′-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3′)[8]。PCR擴(kuò)增體系: 12 μL ddH2O,15 μL PCR Master Mix,matKKIM_3F/1R 引物各1 μL,DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂凝膠糖上電泳檢測(cè), PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行單向測(cè)序。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用Chromas軟件查看序列峰圖,ClustalW進(jìn)行序列比對(duì),通過(guò)人工校正除去兩端不能用的序列,保存成fasta格式和mega格式。利用MEGA 7.0軟件計(jì)算序列之間的突變位點(diǎn)的堿基組成頻率,使用Kimura-2 參數(shù)模型計(jì)算群體間和群體內(nèi)遺傳距離。將序列比對(duì)后的fasta格式文件導(dǎo)入Dnasp 5軟件,計(jì)算51個(gè)茶樹(shù)序列的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性(Hd)、核酸多樣性(Pi)、遺傳分化系數(shù)(Fst)[9]。依據(jù)(1-Fst)/(4Fst)≈Nm的公式求出基因流(Nm)。使用MEGA 7.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建單倍體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),所有的空位做缺失處理,使用鄰接法(NJ)進(jìn)行分析,為檢測(cè)鄰接樹(shù)中每個(gè)分支的支持率,使用自舉法進(jìn)行1 000次計(jì)算[10]。應(yīng)用Dnasp 5軟件對(duì)所有樣本進(jìn)行中性檢驗(yàn)Tajima’s D、Fu and Li’D* and F*及錯(cuò)配分布曲線[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    PCR產(chǎn)物電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖1(截取了10個(gè)品種),設(shè)置陰性對(duì)照,陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,與Marker對(duì)比可知,福建茶種均獲得清晰的800 bp左右的目的條帶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。

    2.2 序列特征和單倍型分布

    51個(gè)福建茶樹(shù)序列比對(duì)后,獲得的序列長(zhǎng)度為833 bp,其中堿基A/T/C/G的組成頻率為36.9%、30.3%、15.8%和17.0%。51個(gè)品種序列共定義了7個(gè)單倍型(表1和表2),單倍型多樣性(Hd)為0.525,核苷酸多樣性(Pi)為0.001 89。其中,常見(jiàn)單倍型有Hap1和Hap3;稀有單倍型有Hap2、Hap4、Hap5、Hap6和Hap7。來(lái)自福鼎、永春和建陽(yáng)原產(chǎn)地的茶樹(shù)樣本少,因此只檢測(cè)到一種單倍型。而來(lái)自武夷山原產(chǎn)地茶樹(shù)樣本多,擁有的單倍型數(shù)最多。在單倍型的分布中,7種單倍型頻率差異較大,頻率分別為64.7%(Hap1)、1.96%(Hap2)、25.5%(Hap3)、1.96%(Hap4)、1.96%(Hap5)、1.96%(Hap6)和1.96%(Hap7)。Hap1出現(xiàn)的頻率最高,說(shuō)明Hap1單倍型較為穩(wěn)定。表2中顯示了這7種單倍型之間的26個(gè)多態(tài)變異位點(diǎn)。

    圖1 部分?jǐn)U增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis for partial amplification products

    表2 基于matK部分序列的單倍型多態(tài)位點(diǎn)

    2.3 單倍體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

    MEGA軟件構(gòu)建的鄰接樹(shù)(圖2),有四大分支,均有較高的自展支持率。Hap2、Hap5和Hap1形成第一進(jìn)化枝,自展支持率為62%,有較近的親緣關(guān)系。第二進(jìn)化枝由Hap6和Hap7組成,具有較高自展支持率83%。Hap3和Hap4單獨(dú)為一個(gè)進(jìn)化枝,說(shuō)明Hap3和Hap4與其他單倍型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    2.4 群體遺傳距離

    應(yīng)用MEGA 7.0軟件選擇Kimura-2 參數(shù)模型檢測(cè)遺傳距離,結(jié)果(表3)顯示,不同茶樹(shù)兩兩群體之間的遺傳距離范圍是0.000 3~0.003 3,群體內(nèi)遺傳距離范圍是0.000 0~0.003 7。最大值存在于武夷山與政和茶樹(shù)群體之間,遺傳距離為0.003 3,說(shuō)明武夷山與政和茶樹(shù)群體親緣關(guān)系遠(yuǎn),遺傳分化程度大,遺傳多樣性高。最小值存在福安和福鼎茶樹(shù)群體之間,遺傳距離為0.000 3,說(shuō)明福安和福鼎茶樹(shù)群體親緣關(guān)系近,遺傳分化程度小,遺傳多樣性低。不同茶樹(shù)群體內(nèi),遺傳距離最小是福鼎茶樹(shù),遺傳距離最大的是政和茶樹(shù)。

    圖2 基于matK部分序列的福建茶樹(shù)的NJ發(fā)育樹(shù)Figure 2 NJ development tree of Fujian tea trees based on matK partial sequence

    表3 群體間(對(duì)角線下)和群體內(nèi)(對(duì)角線上)遺傳距離

    2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)與分化

    通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)福建茶樹(shù)群體間分化系數(shù)Fst=-0.016 22~0.500 00和基因流Nm=-15.663 07~15.210 73(表4)。安溪和福鼎茶樹(shù)群體之間存在高度分化(Fst>0.25),地理隔離產(chǎn)生分化(Nm<1)。福安和安溪、福鼎茶樹(shù)群體;安溪和政和茶樹(shù)群體間均為低度分化(0.054);福安和政和茶樹(shù)群體間基因交流頻率高(Nm>4)。

    表4 福建茶樹(shù)群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)(Fst對(duì)角線下)和基因流(Nm對(duì)角線上)

    2.6 中性檢驗(yàn)與錯(cuò)配分布分析

    福建茶樹(shù)的matK序列的Tajima’s D、Fu and Li’D* and F*中性檢驗(yàn)呈現(xiàn)明顯偏離,且達(dá)到顯著水平(Tajima’sD=-2.392 771,P<0.01;Fu and Li’sD*=-4.576 21,P<0.02;Fu and Li’sF*=-4.523 57,P<0.02),錯(cuò)配分布曲線呈現(xiàn)為單峰模式(圖3),表明福建茶樹(shù)群體可能經(jīng)歷了擴(kuò)張事件,顯著偏離了穩(wěn)定群體。

    實(shí)線代表期望值,虛線代表觀察到的堿基差異分布。圖3 錯(cuò)配分布曲線Figure 3 Mismatch distribution curve

    3 討論與結(jié)論

    單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量遺傳變異的重要指標(biāo),能很好地反映物種的遺傳多樣性水平[12]。研究共檢測(cè)到7種單倍型,單倍型多樣性為0.525,核苷酸多樣性為0.001 89。與核苷酸多樣性相比,單倍型多樣性相對(duì)較高,出現(xiàn)這種情況可能是瓶頸反應(yīng)后茶樹(shù)群體擴(kuò)張的原因。少量堿基突變能迅速增加單倍型多樣性,但很難在短期內(nèi)積累較多的核苷酸變異。Hap2、Hap4、Hap5、Hap6和Hap7為稀有單倍型,出現(xiàn)在福安、武夷山、政和和永春地區(qū)。政和、福鼎和永春地區(qū)茶樹(shù)樣本少,檢測(cè)到的單倍型少。Hap1和Hap3為常見(jiàn)單倍型,表明這兩個(gè)單倍型相對(duì)穩(wěn)定。研究表明,植物DNA單倍體多樣性(hd)的平衡值為0.67,表明51個(gè)福建茶樹(shù)的單倍型多樣性(Hd=0.525)水平低于平均值,從一定程度上說(shuō)明福建茶種的遺傳多樣性是較低的[13]。

    遺傳距離、遺傳分化系數(shù)和基因流是衡量群體多態(tài)性的重要參數(shù)。51個(gè)福建茶樹(shù)樣本根據(jù)原產(chǎn)地分為5個(gè)群體;永春和建陽(yáng)茶樹(shù)樣本數(shù)量各1個(gè),不能構(gòu)成群體,不能反映出永春和建陽(yáng)地區(qū)的遺傳距離、遺傳分化系數(shù)和基因流。

    遺傳距離表明群體間或個(gè)體間的遺傳區(qū)別,它是探究遺傳多樣性的前提,也可以反映群體間演化過(guò)程[14]。武夷山與其他4個(gè)茶樹(shù)群體間的遺傳距離(0.001 5~0.003 3)大于這4個(gè)茶樹(shù)群體兩兩之間的遺傳距離(0.000 3~0.002 5);福安與福鼎茶樹(shù)群體間的遺傳距離為0.000 3;福安與政和茶樹(shù)群體間的遺傳距離為0.002 2;福安與福鼎茶樹(shù)群體親緣關(guān)系較近,而與政和茶樹(shù)群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)分析種群內(nèi)及種群間遺傳多樣性分析,可以為資源圃內(nèi)的茶樹(shù)引種提供參考。

    遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)表征群體間遺傳分化程度。當(dāng)Fst介于0~0.05,群體間差異??;當(dāng)Fst介于0.05~0.15,群體間分化程度低;當(dāng)Fst介于0.15~0.25,說(shuō)明群體間分化程度中等;當(dāng)Fst大于0.25時(shí),表明群體間分化程度高[15]。當(dāng)Nm大于4,表明群體隨機(jī)交配;當(dāng)Nm小于1,表明群體可能朝著遺傳分化的方向發(fā)展。武夷山與安溪、福鼎、政和茶樹(shù)群體間Fst均小于0.05,Nm均大于4,表明武夷山與這3個(gè)茶樹(shù)群體之間遺傳分化很小,基因交流頻繁。福安與福鼎茶樹(shù)群體間的Fst為0.107 41,Nm為2.083 40,表明福安和福鼎茶樹(shù)群體之間存在低度分化,有不同程度的交流。福安與政和茶樹(shù)群體間Fst為0.016 17,Nm為15.210 73,表明福安和政和茶樹(shù)群體之間無(wú)差異并隨機(jī)交配。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因:一方面可能與茶樹(shù)栽培的選育方法有關(guān),除自然條件外不同群落的遷移和雜交,骨干親本相似;也存在人工引種使不同地區(qū)的茶樹(shù)不斷雜交,不同群體的茶樹(shù)基因交流頻繁,群體親緣關(guān)系密切[16]。另一方面,在實(shí)驗(yàn)期間,茶樹(shù)的樣本數(shù)量因地區(qū)而異,對(duì)茶樹(shù)群體結(jié)構(gòu)和遺傳分化的研究在一定程度上被削弱。

    通過(guò)福建茶樹(shù)兩兩序列變異的中性檢驗(yàn)及錯(cuò)配分布曲線分析結(jié)果表明,福建茶樹(shù)群體在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了群體擴(kuò)張。出現(xiàn)擴(kuò)張事件的原因可能是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的育種栽培,一些有良好品質(zhì)的福建茶樹(shù)被大規(guī)模種植,遺傳多樣性降低。

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