分光光度法檢測(cè)奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)合在脂肪肝細(xì)胞的作用

高 川 付海洋 劉 敏 周奎臣

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)包括了非酒精性脂肪肝(NAIL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NASH疾病發(fā)展嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)，必要時(shí)須進(jìn)行肝臟移植。近些年來(lái)，NAFLD的發(fā)病率越來(lái)越高，NASH患病率也進(jìn)一步增加,并且NAFLD尚無(wú)公認(rèn)的特效治療方法[1，2]。奧貝膽酸(Obeticholic acid，OCA)，是法尼酯 X受體(Farnesoid X receptor, FXR)的天然配體，能夠調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞再生，保護(hù)肝臟，但其存在瘙癢等不良炎癥反應(yīng)[3]。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)具有很好的抗炎癥、抗氧化效果[4]。SOD和MDA是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的兩個(gè)指標(biāo)，檢測(cè)方法有ELISA、蛋白凝膠電泳、分光光度法等。本文用分光光度法檢測(cè)OCA聯(lián)合RSV在NAFLD細(xì)胞模型上的應(yīng)用，以評(píng)價(jià)抗氧化應(yīng)激和降脂效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藥品：奧貝膽酸(廈門海樂景生化有限公司);白藜蘆醇(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)；試劑：游離脂肪酸(棕櫚酸∶油酸=1∶2，棕櫚酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，油酸：西隴科學(xué)股份有限公司);MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

儀器：紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器(蘇州)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

以HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105/mL，加入24孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。

1.3 藥物干預(yù)

細(xì)胞貼壁后，加入正常培養(yǎng)基的為對(duì)照組(CON),其余組在均加入含有500 μmol/L游離脂肪酸的培養(yǎng)基后，分為模型組(MOD)、聯(lián)合用藥組(OCA+RSV)、奧貝膽酸組(OCA)，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；各給藥組加入各藥物的濃度為5 μmol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 結(jié)果檢測(cè)

培養(yǎng)完成后，取各組的培養(yǎng)液300 μL分別裝在1.5 mL的EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 油紅染色

藥物作用后各孔除去培養(yǎng)液并用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定10 min；吸去多聚甲醛再用PBS洗滌2次，用60%的異丙醇溶液洗滌細(xì)胞1 min；去除異丙醇溶液加入油紅染色液染色10 min；加入蒸餾水終止染色，吸去液體在倒置顯微40×10倍鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)果，如圖1。

1.4.2 氧化應(yīng)激檢測(cè)

取備好的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，按照試劑盒說(shuō)明配液，利用分光光度儀檢測(cè)吸光度，MDA在532 nm、SOD在550 nm處有最大吸收，計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和MDA的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

各組細(xì)胞的油紅染色結(jié)果顯示(圖1)，在游離脂肪酸刺激下細(xì)胞脂質(zhì)增多，加入藥物的兩組差別不大，都對(duì)細(xì)胞的脂肪變起到一定的抑制效果，與模型組對(duì)比，細(xì)胞脂質(zhì)均明顯減少。

圖1 油紅染色結(jié)果

分光光度法檢測(cè)MDA含量精確度可達(dá)0.01 nmol/mL,SOD活性值精確度達(dá)0.01 U/mL。經(jīng)檢測(cè)，OCA能夠降低MDA含量和SOD活性，均值分別為17.75 nmol/mL和32.66 U/mL。但聯(lián)合用藥的效果更好，MDA含量均值為9.38nmol/mL，SOD活性降低也較明顯。P<0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

NAFLD是全球發(fā)病最高的慢性肝病，發(fā)病機(jī)制主要以“二次打擊學(xué)說(shuō)”為主?！暗谝淮未驌簟笔怯捎诜逝帧⑻悄虿〉纫蛩貙?dǎo)致肝臟中脂肪堆積，形成單純性脂肪肝，“第二次打擊”是由于炎癥、氧化應(yīng)激、脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂等因素對(duì)肝臟的損傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致NASH 甚至纖維化等[5]。迄今為止，依然沒有治療本病的特效西藥，臨床大多從抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎、調(diào)脂等方面進(jìn)行治療，但單一的治療方法并不能取得很好的治療效果。

奧貝膽酸為一種特異很強(qiáng)的FXR受體激動(dòng)劑，該藥臨床上主要應(yīng)用于膽汁性膽管炎[6]，在NAFLD的治療中取得一定療效。目前該藥還處于臨床試驗(yàn)階段，目前發(fā)現(xiàn)其有皮膚瘙癢、血脂異常等副作用，預(yù)計(jì)通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)的改良升級(jí)或采取聯(lián)合用藥等方式可改善其副作用并拓寬用藥范圍，有望應(yīng)用于NAFLD患者的臨床治療[7]。

白藜蘆醇作為天然抗氧化劑，降低MDA水平，可增加細(xì)胞內(nèi)SOD分子的表達(dá)，與細(xì)胞代謝及壽命具有緊密聯(lián)系，同時(shí)研究顯示其還具有顯著的抗感染、抗腫瘤、抗高脂血癥等活性[8]。

綜上所述，本文選用分光光度法檢測(cè)OCA和RSV聯(lián)合用藥作用于HepG2細(xì)胞非酒精性脂肪肝模型的作用。聯(lián)合用藥能夠降低細(xì)胞的脂肪變，同時(shí)降低細(xì)胞發(fā)生脂肪變時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷和死亡，比單獨(dú)使用OCA取得更好的療效，有進(jìn)一步進(jìn)行深入研究的價(jià)值。