青蒿素衍生物抗癌活性研究

陳 歡 代天志 孫德群

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010)

近 20 年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)和工業(yè)化的發(fā)展，空氣污染、生活方式改變、人口老齡化等使中國(guó)疾病譜發(fā)生了巨大變化，但是癌癥仍然是目前全世界人類死亡的最主要原因之一。在中國(guó)，男性最常見(jiàn)的癌癥類型是肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌和食道癌，而乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和宮頸癌是中國(guó)女性的主要癌癥類型[1]。我國(guó)每天將近有1萬(wàn)人確診癌癥，這相當(dāng)于平均每分鐘就會(huì)有7個(gè)人診斷出癌癥。除了實(shí)體瘤的患病率高外，近年來(lái)人們對(duì)白血病的關(guān)注度也逐漸增高，死亡率占各類腫瘤的第六位，預(yù)后差，且兒童是白血病的高發(fā)人群。在2010年前就有文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)的白血病患兒有200多萬(wàn)，并且每年以3～4萬(wàn)的速度增加[2]。癌癥越來(lái)越低齡化和多藥耐藥性的頻繁出現(xiàn)[3-5]，使尋找有效的新抗癌潛在藥物迫在眉睫。

青蒿素(Artemisinin)是我國(guó)科學(xué)家屠呦呦于1972年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離出的一種萜類化合物。經(jīng)長(zhǎng)期臨床研究表明，青蒿素是繼乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的抗瘧特效藥，曾被世界衛(wèi)生組織稱作是“世界上唯一有效的抗瘧疾藥物”[6-8]。由于青蒿素在抗瘧疾上所做的巨大貢獻(xiàn)，人們掀起了對(duì)青蒿素研究的熱潮，近年來(lái)的許多研究表明，青蒿素及其衍生物不僅是天然的抗瘧疾藥，也是有效的抗癌藥。比如：青蒿琥酯對(duì)白血病、結(jié)腸、黑色素瘤、乳腺、卵巢、前列腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和腎癌細(xì)胞具有抑制活性[9]；雙氫青蒿素對(duì)胰腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞也有顯著的抗腫瘤活性，而且青蒿酮表現(xiàn)出比青蒿素更好的活性，并與其他抗癌藥物有相當(dāng)大的協(xié)同作用[10-11]。Galal等對(duì)60種腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行的體外抗腫瘤活性測(cè)定中，所合成的12種雙氫青蒿素縮醛二聚體對(duì)非小細(xì)胞肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、白血病細(xì)胞等癌細(xì)胞的IC50值在0.019～8.700 μmol/L之間。課題組前期對(duì)青蒿素衍生物的研究數(shù)據(jù)也表明青蒿素衍生物抗癌活性的顯著及研究?jī)r(jià)值[12-14]。在進(jìn)行相關(guān)的藥理機(jī)理研究中，人們發(fā)現(xiàn)青蒿素類化合物強(qiáng)大的抗癌作用歸因于一個(gè)特殊的活性結(jié)構(gòu)——過(guò)氧基團(tuán)。過(guò)氧基團(tuán)與鐵和血紅素或血紅素結(jié)合蛋白的相互作用，不僅能擾亂癌細(xì)胞中相關(guān)鐵代謝，還促發(fā)自身細(xì)胞毒性，使癌細(xì)胞死亡[15-17]。除此之外，在細(xì)胞中被鐵激活的青蒿素類化合物會(huì)釋放高烷基化自由基和活性氧自由基，進(jìn)而促進(jìn)凋亡、抑制生長(zhǎng)、抑制血管生成、抑制癌細(xì)胞侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和DNA損傷，激發(fā)相關(guān)細(xì)胞凋亡通路(線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路)等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在癌細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白和低表達(dá)的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶，使青蒿素類化合物具有良好選擇性[18-20]。綜上所述，對(duì)青蒿素進(jìn)行有效的結(jié)構(gòu)修飾具有重要意義。

本文以青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成了新青蒿素衍生物D-21，并通過(guò)體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和一系列熒光染色實(shí)驗(yàn)來(lái)證明新青蒿素衍生物D-21 的抗癌活性。

1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.1 主要試劑和儀器

試劑：DMEM，RPMI-1640，IMDM培養(yǎng)基，胰酶消化液，Hyclone；胎牛血清(FBS)，Natocor；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)，中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；Hoechst 33258，Annexin V-FITC ，PI，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)，中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；阿霉素(DOX)，中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；苯丁酸氮芥，安耐吉化學(xué)公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、濃鹽酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

儀器：XD20-RFL倒置熒光顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；5404型低速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SH-1000 Lab型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Corona Electric；KG-SX-700型高溫蒸汽滅菌鍋；KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 試劑的制備

DMEM完全培養(yǎng)基的配制：取20 mL FBS(胎牛血清)和2 mL青霉素鏈霉素溶液加入到DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基至最終培養(yǎng)基體積為200 mL，使完全培養(yǎng)基中FBS約為10%,PS約為1%，并于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DMEM維持培養(yǎng)基的配制：取5 mL FBS(胎牛血清)和2 mL青霉素鏈霉素溶液加入到DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基至最終培養(yǎng)基體積為200 mL，使完全培養(yǎng)基中FBS約為2.5%,PS約為1.0%，并于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RPMI-1640和IMDM完全培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基的配制方法同上。

MTT溶液的配制：稱取500 mg的MTT粉末，用100 mL的PBS(磷酸鹽緩沖溶液)溶解后，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，EP管分裝并置于-20 ℃ 冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

三聯(lián)裂解液的配制：稱取SDS (十二烷基硫酸鈉)10 g，異丁醇5 mL，10 mol/L HCl 0.1 mL用雙蒸水溶解并配成100 mL 溶液，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后，滅菌常溫保存。

磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制：稱取1.600 g NaCl，0.040 g KCl，0.694 g Na2HPO4·12H2O，0.040 g K2HPO4溶解于200 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，滅菌常溫保存。

1.3 細(xì)胞株

本文中用于研究的人正常肝細(xì)胞系L02、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U118-MG、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞系CCRF-CEM、人慢性髓原白血病細(xì)胞系K562和人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60均購(gòu)自上海攬寶(Shanghai Labpal)。

1.4 新青蒿素衍生物D-21結(jié)構(gòu)式

新青蒿素衍生物D-21由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院藥物合成實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成，并經(jīng)氫譜、碳譜、質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)式。

m.p.: 60.1～61.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.97 (s, 1H), 7.92 (d,J=8.3 Hz, 1H), 7.16 (d,J=8.3 Hz, 1H), 6.00 (d,J=9.8 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 3.56 ～3.46 (m, 8H), 2.74 (s, 1H), 2.40 (d,J=17.8 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.05 (d,J=14.4 Hz, 1H), 1.91 (d,J=13.7 Hz, 1H), 1.83 (s, 1H), 1.75 (d,J=16.1 Hz, 1H), 1.68 (d,J=13.7 Hz, 1H), 1.57～ 1.45 (m, 2H), 1.43 (s, 3H), 1.35 (d,J=36.8 Hz, 2H), 1.10～1.02 (m, 1H), 0.98 (d,J=6.1 Hz, 3H), 0.91 (d,J=7.1 Hz, 3H)。13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 165.01, 151.95, 134.37, 133.71,128.75, 125.15, 122.43, 104.41, 92.40,91.60,80.22,77.29,77.04,76.78, 55.18, 51.70,45.39,41.43,37.31, 36.29, 34.17, 32.07, 25.97,24.62,22.10,20.25,18.50,12.25。HRMS (ESI) m/z calcd. for [C27H37Cl2NO6H+]: 542.199 8, Found, 542.171 6。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116，A549，SHSY-5Y，U118-MG細(xì)胞系所用培養(yǎng)液為DMEM完全培養(yǎng)基，CCRF-CEM，K562，L02細(xì)胞系所用培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)基，HL-60細(xì)胞系所用培養(yǎng)液為IMDM完全培養(yǎng)基。上述細(xì)胞均在條件為37 ℃，5% CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測(cè)D-21抗腫瘤活性

2.2.1 貼壁細(xì)胞

(1)接種細(xì)胞：待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，并用完全培養(yǎng)基將消化下來(lái)的細(xì)胞制成適當(dāng)細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μL。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)藥物的配制和細(xì)胞給藥：培養(yǎng)24 h后，用DMSO溶解待測(cè)化合物，配成初始藥物濃度為10 μmol/L，并用維持培養(yǎng)基配制最終藥物濃度為0.04，0.40，2.00，10.00，20.00，40.00 μmol/L 共6組，并設(shè)置空白對(duì)照組。輕輕吸棄培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)液，每孔中加入100 μL各濃度的藥物(每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(3)檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，輕輕吸棄培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄孔內(nèi)溶液，再向各孔加入100 μL DMSO溶解，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm 的吸光值。按公式(1)計(jì)算待測(cè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，并通過(guò)SPSS軟件計(jì)算其IC50。

抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組

平均OD值)×100%

(1)

2.2.2 懸浮細(xì)胞

(1)接種細(xì)胞與細(xì)胞給藥：待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基混懸細(xì)胞并制成適當(dāng)濃度的初始細(xì)胞懸液，然后用此細(xì)胞懸液配制成含不同藥物濃度的最終細(xì)胞懸液，最后接種于96孔板中，每孔90 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL濃度5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL三聯(lián)裂解液，培養(yǎng)箱中孵育10 h，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm的吸光值。按前述方法計(jì)算其IC50。

2.3 D-21對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響觀測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCRF-CEM細(xì)胞接種于24孔板中，用維持培養(yǎng)基制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，0.625，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細(xì)胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用ImageView軟件拍照保存。

2.4 D-21不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制試驗(yàn)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCRF-CEM細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.00，0.05，0.10，0.50，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00 μmol/L，然后將此不同濃度的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放入孵箱中分別培養(yǎng)24，48，72 h，每組時(shí)間重復(fù)3次；用MTT法檢測(cè)波長(zhǎng)在570 nm的吸光值，算出IC50值后，用軟件GraphPad Prism 8處理數(shù)值并繪制CCRF-CEM細(xì)胞經(jīng)新青蒿素衍生物D-21不同濃度和不同作用時(shí)間處理的抑制活性曲線圖。

2.5 Hoechst 33258染色

2.5.1 藥物配制：用DMSO溶解待測(cè)化合物，配成初始藥物濃度為10 mmol/L，-20 ℃ 保存。

2.5.2 細(xì)胞接種及給藥：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，0.625，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細(xì)胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養(yǎng)24 h。

2.5.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，將Hoechst 33258儲(chǔ)備液用PBS稀釋成10 μg/mL，PBS洗細(xì)胞兩次后，每管加入稀釋后的染色液200 μL，室溫避光孵育20 min后，離心除去染色液，用PBS小心清洗細(xì)胞2次；將染色后的細(xì)胞重新接種于24孔板中，并在熒光顯微鏡下觀察拍照；整個(gè)過(guò)程盡量避光操作。

2.6 Annexin V-FITC and PI 染色

2.6.1 藥物配制：方法同2.5.1節(jié)

2.6.2 細(xì)胞接種及給藥：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細(xì)胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養(yǎng)24 h。

2.6.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，PBS洗滌細(xì)胞，加入195 μL染色結(jié)合液重懸細(xì)胞后，再依次分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光20 min(期間可重懸細(xì)胞，以便細(xì)胞和染色液充分作用)，隨后將細(xì)胞接種于24孔板中靜置于冰浴片刻后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。整個(gè)過(guò)程盡量避光操作。

2.7 線粒體膜電位(JC-1)染色

2.7.1 藥物配制：方法同2.5.1節(jié)

2.7.2 細(xì)胞接種及給藥：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細(xì)胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養(yǎng)24 h。

2.7.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，PBS洗滌細(xì)胞，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL染色工作液，充分混勻后在培養(yǎng)箱中孵育20 min；孵育結(jié)束后，離心除去上清液(2 000 r/min ，4 ℃，4 min)，并用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌細(xì)胞2次；將JC-1染色緩沖液(1X)重懸的細(xì)胞接種于24孔板中，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。整個(gè)過(guò)程盡量避光操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 化合物對(duì)8種腫瘤細(xì)胞系的抗腫瘤活性

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定了化合物對(duì)CCRF-CEM，SH-SY5Y，U118-MG，A549，HCT-116細(xì)胞系的抗腫瘤活性，用正常肝細(xì)胞L02來(lái)測(cè)定化合物的毒性。以雙氫青蒿素(DHA)、阿霉素(DOX)、苯丁酸氮芥(DZ)為陽(yáng)性對(duì)照，如表1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成的新青蒿素衍生物D-21 對(duì)癌細(xì)胞普遍具有較好活性，特別是對(duì)白血病細(xì)胞系CCRF-CEM的增長(zhǎng)抑制作用顯著，其 IC50值 0.602±0.252 μmol/L，達(dá)納摩爾級(jí)，這對(duì)潛在的抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

因?yàn)楹芏嘌芯恳呀?jīng)表明含氮芥類的衍生物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系特別是白血病細(xì)胞系具有顯著的抗腫瘤活性[21-22]，為了進(jìn)一步驗(yàn)證本課題組合成的青蒿素衍生物是否對(duì)其他白血病細(xì)胞有抗增殖作用，我們又測(cè)定了新青蒿素衍生物D-21對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞系K562和人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60 這兩株細(xì)胞系的抗細(xì)胞增殖作用。

從表1的總體數(shù)據(jù)可以得出，新青蒿素衍生物D-21 對(duì)所選的腫瘤細(xì)胞系均有較好抗增殖作用，特別是對(duì)白血病細(xì)胞株具有更強(qiáng)的細(xì)胞活性，且對(duì)急性白血病細(xì)胞系的抗增殖作用好于慢性白血病細(xì)胞系。因此，我們決定進(jìn)一步研究新青蒿素衍生物D-21對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的初步抗腫瘤機(jī)制。

表1 青蒿素衍生物對(duì)8種細(xì)胞株的抑制活性(x±SD，n=3)Table 1 Inhibitory activities of new artemisinin derivative against eight cancer cell lines(x±SD，n=3)

3.2 D-21不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

如圖1所示，新青蒿素衍生物D-21對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。當(dāng)藥物(10 μmol/L)作用24 h后，細(xì)胞抑制率達(dá)50%以上，表明抑制效果顯著。

圖1 新青蒿素衍生物D-21不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的增殖抑制率曲線Fig.1 Proliferation inhibition rate curve of new artemisinin derivative D-21 on CCRF-CEM cells at different concentrations and time

3.3 D-21對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞形態(tài)的驟變、空泡的出現(xiàn)是腫瘤細(xì)胞早期凋亡的直觀表象，可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞外觀的觀察來(lái)初步判斷化合物對(duì)細(xì)胞的作用情況。如圖2所示，CCRF-CEM細(xì)胞經(jīng)新青蒿素衍生物D-21處理后發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。隨著新青蒿素衍生物D-21濃度的增加，細(xì)胞開(kāi)始皺縮，細(xì)胞膜完整性受損，這種變化說(shuō)明細(xì)胞骨架已崩解，細(xì)胞逐漸死亡，尤其是當(dāng)新青蒿素衍生物D-21濃度達(dá)到 1.25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，表明新青蒿素衍生物D-21細(xì)胞毒性作用顯著。

圖2 新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Morphology of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

3.4 Hoechst 33258染色結(jié)果分析

為了確定新青蒿素衍生物D-21誘導(dǎo)的抗增殖活性是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)行了Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)。Hoechst 33258染色可初步評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡，經(jīng)染料孵育后可直接觀察到細(xì)胞的熒光圖像。根據(jù)染色機(jī)理，正常細(xì)胞呈弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞因凋亡導(dǎo)致染色質(zhì)固縮而呈強(qiáng)藍(lán)色熒光。如圖3所示，新青蒿素衍生物D-21的加入使細(xì)胞比空白對(duì)照組表現(xiàn)出更亮的藍(lán)色熒光，并且呈現(xiàn)強(qiáng)熒光的細(xì)胞量明顯隨著藥物濃度的增加而增加。當(dāng)新青蒿素衍生物D-21濃度在0.625 μmol/L時(shí)，孔板內(nèi)就出現(xiàn)了形狀不同的凋亡小體，細(xì)胞質(zhì)濃縮，說(shuō)明新青蒿素衍生物D-21以濃度依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 Hoechst 33258對(duì)新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細(xì)胞染色圖Fig.3 Hoechst 33258 staining picture of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

3.5 Annexin V-FITC and PI 染色結(jié)果分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)新青蒿素衍生物D-21的細(xì)胞活性是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)行了Annexin V-FITC和PI染色實(shí)驗(yàn)。Annexin V是一種膜黏蛋白，它能選擇性地與細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。磷脂酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)部。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸翻出到細(xì)胞膜表面的現(xiàn)象，這是細(xì)胞凋亡的重要特征。Annexin V-FITC是一種用綠色熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，根據(jù)Annexin V-FITC與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合，就能知道磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜表面的分布情況，從而檢測(cè)出細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。PI可對(duì)凋亡后期壞死細(xì)胞或細(xì)胞膜失去完整性的細(xì)胞進(jìn)行染色，然后呈現(xiàn)紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙重染色，可以更全面地驗(yàn)證該化合物是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如圖4所示，隨著化合物濃度的增加，綠色和紅色熒光明顯增強(qiáng)。表明新青蒿素衍生物D-21可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。

3.6 線粒體膜電位(JC-1)染色結(jié)果分析

細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一是線粒體膜通透性的改變，隨后一些促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)然后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中凋亡現(xiàn)象之一就是線粒體膜電位的降低。在此，用熒光探針JC-1研究了新青蒿素衍生物D-21對(duì)線粒體膜電位的影響。JC-1是廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，可用于早期細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成一種聚合體(J-聚集體)并產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能進(jìn)入線粒體基質(zhì)，JC-1以單體形式產(chǎn)生綠色熒光。因此，可以通過(guò)熒光顏色檢測(cè)線粒體膜電位的變化。如圖5所示，與對(duì)照組相比，新青蒿素衍生物D-21處理的CCRF-CEM細(xì)胞發(fā)散的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新青蒿素衍生物D-21可以通過(guò)改變線粒體膜的去極化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖5 新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細(xì)胞線粒體膜電位(JC-1)染色圖Fig.5 JC-1 staining picture of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

4 結(jié)論與展望

新青蒿素衍生物D-21對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、肺癌細(xì)胞A549、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-6、人急性白血病細(xì)胞CCRF-CEM有顯著的抗增殖活性，使D-21躍升為抗癌藥成為可能。抗癌活性的初步探討也證明了隨著D-21濃度的增加，受線粒體膜電位相關(guān)凋亡通路影響，腫瘤細(xì)胞快速凋亡。

雖然人們對(duì)青蒿素及其衍生物已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但是像新青蒿素衍生物D-21這種具有顯著抗癌活性的化合物卻未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)可以充分證明新青蒿素衍生物D-21有非常大的潛在研究意義，可進(jìn)一步研究新的藥理機(jī)理，為今后抗癌藥物的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。