TMPRSS11B在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

李丹蘋，莫穎禧，吳 姝，韓培培，李麗媚，趙 軍，張海山，李 萍

[1.廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級重點實驗室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點實驗室（廣西高校重點實驗室），南寧 530021；5.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會口腔感染性疾病防治重點實驗室，南寧 530021；6.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021；7.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021]

口腔癌是多見的頭頸部腫瘤，侵襲性高，易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，臨床上以口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)最為多發(fā)，占其發(fā)病率的90%。OSCC 通常發(fā)生在舌前2/3、牙齦、口腔底部、唇頰黏膜、牙槽嵴、硬腭以及磨牙后三角區(qū)[1]。盡管手術(shù)、化療、放療、造血細胞移植和靶向治療已經(jīng)取得良好的效果[2]，但腫瘤侵襲、頜面部破壞、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血源性傳播，仍使OSCC 成為一種致命的畸形性疾病[3]。因此，尋找有效的OSCC 診斷和預(yù)后的生物標志物，探究存在的信號通路及可能機制，能大幅提升OSCC患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（TypeⅡtransmembrane serine protease,TTSP）家族是本世紀初新揭示的一種蛋白酶家族[4]，早期研究表明，TTSPs在上皮組織中廣泛表達[5]，并在上皮分化、鐵代謝等多種生理過程中起關(guān)鍵作用[6]。近年來有關(guān)TTSPs致癌作用的研究不斷進展，已證明TTSPs 參與了上皮癌變，與癌癥復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和死亡率密切相關(guān)[7]，還具有靶向治療癌癥的潛力[8-10]?？缒そz氨酸蛋白酶11B(transmembrane serine protease 11B,TMPRSS11B)屬于TTSP 家族。TMPRSS11B 蛋白由一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成，具有催化三聯(lián)體及結(jié)合底物的殘基。主要位于上皮細胞表面，在子宮頸癌、食道癌和頭頸癌中明顯下調(diào)[11]。有研究表明，TMPRSS11B 可能在調(diào)節(jié)腫瘤進展上發(fā)揮作用[12]。然而，TMPRSS11B 在OSCC 中的研究甚少，為探究與OSCC 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子生物學標志物，本文重點探索了TMPRSS11B 基因在OSCC 中的表達變化，及其與OSCC 患者臨床病理指標的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫 從癌癥基因組學數(shù)據(jù)分析平臺（UCSC Xena，http://xena.ucsc.edu/)中檢索并下載頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSC) 的TCGA數(shù)據(jù)集，包括mRNA信息和相應(yīng)的臨床參數(shù)。篩選出牙槽嵴、頰粘膜、口底、舌、唇和硬腭等口腔各部位的數(shù)據(jù)[13]，并剔除掉mRNA表達及臨床參數(shù)不完全的數(shù)據(jù)，分析TMPRSS11B在OSCC 患者組織和口腔正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2 生存分析和診斷價值分析 提取TCGA 樣本中OSCC 患者的生存數(shù)據(jù)，以TMPRSS11BmRNA水平的中位數(shù)作為截斷值。將OSCC 患者分為兩組，TMPRSS11B 高表達組和低表達組，以O(shè)SCC 所致死亡作為所有患者的預(yù)后標準，利用Kaplan-Meier 法作生存曲線，分析兩個分組的患者的生存率；采取受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）來判斷TMPRSS11B 診斷OSCC的敏感性和特異性；采用曲線下面積(area under the curve,AUC) 分 析TMPRSS11B 的 診 斷 價值；采用約登指數(shù)確定TMPRSS11B的最佳臨界值。

1.3 GeneMANIA預(yù)測TMPRSS11B互作基因

Gene MANIA數(shù)據(jù)庫是一個通過大量基因組學和蛋白組學數(shù)據(jù)找到功能相似的基因的網(wǎng)站[14]。在其主頁（http://genemania.org）搜索TMPRSS11B，定義物種為人，并根據(jù)基因間的現(xiàn)有的相互作用找到可能相同功能的基因，從而繪制出TMPRSS11B 的互作基因網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析 打開DAVID 數(shù)據(jù)庫[the database for annotation,visualization and integrated discovery (https://david.ncifcrf.gov/)]對TMPRSS11B 進行GO(gene ontology，GO)功能注釋和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

1.5 細胞和組織 人口腔上皮細胞（HOEC細胞）、口腔癌細胞株（CAL27、SAS 細胞）均購于上海雅吉生物科技有限公司。收集2020年6～12月廣西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院病理科55 例OSCC 組織及配對的相鄰非癌組織石蠟塊（距離腫瘤邊緣至少5 cm處）。其中男19 例，女36 例，年齡27～91 歲，平均58 歲。病例納入標準：（1）經(jīng)兩位高水平病理醫(yī)師診斷為口腔鱗狀細胞癌的患者；（2）術(shù)前未受任何放、化療、免疫療法或靶藥療法的患者；（3）臨床材料完備的患者。排除標準：（1）拒絕參加實驗的患者；（2）有其他惡性腫瘤或全身性疾病的患者；（3）病理診斷不明晰的患者。本研究已獲廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會倫理審批（批號：2021028），并得到所有招募患者的知情同意。

1.6 試劑 Gibco 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和100 U青霉素/鏈霉素，DEPC-Treated Water、Trizol 試劑、PowerUP SYBER Green Master MIX和TMPRSS11B多克隆抗體（貨號：PA5-31481）購于賽默飛公司（美國）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒The TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis superMix 購于北京全式生物科技有限公司。PV-6000免疫組化通用型試劑盒、EDTA（pH=9）抗原修復(fù)液、DAB 顯色試劑盒和碳酸鋰飽和溶液均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.7 細胞培養(yǎng) HOEC 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，SAS、CAL27用DMEM-F12培養(yǎng)，配置10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素，將細胞放至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37 ℃，CO2體積為5%，濕度為飽和濕度。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

HOEC、CAL27、SAS 細胞RNA 由TRIzol 提取，后將其逆轉(zhuǎn)為互補DNA（cDNA）。RT-qPCR 采用StepOnePlus?實時熒光定量PCR 儀(美國賽默飛公司)進行。使用SYBER Green 試劑盒進行qRTPCR。反應(yīng)體系總體積為20μL[10 ulSYBER Green（2×），7 μL DEPC 水，1 μL cDNA，1 μL 上游引物，1μL 下游引物]。引物序列為：TMPRSS11B：正向：5'-GTAAGCTGGGGTGATGGATGT-3'，反 向：5'-ATCCTTATCTGTGGCTTTGGGA-3'。GAPDH：正向：5'-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3'，反向：5'-CCC-CTTCATTGACCTCAACTACA-3'。反應(yīng)條件為，98 ℃預(yù)變性30 s，1 輪循環(huán)。98 ℃15 s，65 ℃60 s，72 ℃90 s 40輪循環(huán)。內(nèi)參標準是GAPDH，每個樣品提供3 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次?；蛳鄬Ρ磉_水平算法為2-ΔΔCt方法。

1.9 免疫組織化學(IHC)染色 組織石蠟塊切片，厚4μm。將切片置于二甲苯中脫蠟，再于梯度酒精（100%，95%，85%和75%）中水化。采用EDTA修復(fù)液（pH=9）在高壓鍋修復(fù)5 min，常溫至徹底冷卻。之后使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min。滴加TMPRSS11B抗體（1∶250)，孵育一夜。次日采用酶標山羊抗小鼠/兔IgG孵育20 min。現(xiàn)配DAB，爾后滴加染色。在蘇木精中染色30 s，并在0.5%的鹽酸中分化，在碳酸鋰中反藍。在梯度酒精（75%，85%和95%）中脫水。在二甲苯中透明，用中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。實驗均設(shè)置陽性對照和陰性對照。IHC片由2名病理醫(yī)師單獨打分。評分標準根據(jù)陽性細胞染色程度和染色面積對TMPRSS11B 蛋白的表達做半定量分析。先通過低倍鏡（×100）尋找OSCC細胞和（或）正常口腔鱗狀上皮細胞，然后換成高倍鏡（×400)。打分者挑取10個視野，在每一視野下觀察100 個完整OSCC 細胞和/或正?？谇击[狀上皮細胞。無陽性著色計0 分，著色強度呈淺黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3分。陽性細胞百分比＜10%判0 分；10%～40%判1分；＞40%～70%判2 分；≥70%判3 分。兩標準得分的乘積作為TMPRSS11B 最末分。評分＜3 分為低表達，≥3分為高表達。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，配對樣本采取配對樣本t檢驗。計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 檢驗法進行生存分析，采用AUC 判評TMPRSS11B 的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS11B在OSCC組織中mRNA水平

從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出287例口腔癌標本和31 例正常口腔標本。與正?？谇唤M織相比，TMPRSS11B 在OSCC 組織的mRNA 水平明顯下調(diào)（t=7.058，P＜0.05)，見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中OSCC 組織TMPRSS11B mRNA 水平下調(diào)

2.2 Kaplan-Meier 曲 線分析TMPRSS11B 在OSCC中的預(yù)后價值 生存分析結(jié)果顯示，TMPRSS11B轉(zhuǎn)錄水平與OSCC 預(yù)后相關(guān)，與TMPRSS11B 高表達組相比，低表達組患者總生存率較低(P＜0.05)，見圖2。

圖2 TMPRSS11B低表達組的OSCC患者預(yù)后不良

2.3 TMPRSS11B的mRNA水平對OSCC的診斷價值 基于287例OSCC組織與31例正?？谇唤M織的mRNA水平，檢測出TMPRSS11B mRNA的AUC為0.793（95%CI：0.697～0.889，P＜0.05），提示TMPRSS11B 可能作為OSCC 的診斷指標（P＜0.05），見圖3。此外，TMPRSS11B的靈敏度為94.5%，特異度為59.4%，其最佳臨界值（AUC）為0.716。

圖3 OSCC中TMPRSS11B的轉(zhuǎn)錄水平的ROC曲線

2.4 TMPRSS11B 的互作基因及其GO 分析和KEGG 通路分析 TMPRSS11B 的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)以TMPRSS11B為中心點，多個互作基因呈扇形展開，基因節(jié)點的大小與互作強度呈正比，TMPRSS11B的互作基因根據(jù)互作強度由強到弱順序分別為

TMPRSS11E、KIF9、TMPRSS11D、LHFPL1、KLK13、COX7B2、SERPINB13、LDHAL6B、RHOV、1-Dec、CRISP3、TAS2R7、USP26、PRSS27、HERC3、MYOCD、IFNB1、OR2L13、HS3ST2、SCEL，見圖4。

圖4 GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫預(yù)測TMPRSS11B 的基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

GO分析顯示，TMPRSS11B及其相互作用基因的生物過程主要涉及角化細胞分化、角質(zhì)化和多肽交聯(lián)等11個方面(P＜0.05)，細胞成分集中在胞外外泌體、角化包膜、細胞間黏附連接等15項(P＜0.05)，分子功能集中在結(jié)構(gòu)分子活性、鈣離子結(jié)合和鈣粘蛋白結(jié)合參與細胞—細胞黏附等8 項(P＜0.05)，見圖5。

圖5 TMPRSS11B互作基因的GO分析

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，與TMPRSS11B 共表達基因密切相關(guān)的通路為代謝途徑、花生四烯酸代謝、PPAR信號通路、細胞色P45代謝、AMPK信號通路和軸突導(dǎo)向等，見圖6。

圖6 TMPRSS11B互作基因的KEGG通路分析

2.5 RT-qPCR法檢測TMPRSS11B在口腔癌細胞中的mRNA 水平 口腔癌細胞株（CAL27、SAS）中的TMPRSS11B 的mRNA 水平較正?？谇簧掀ぜ毎鸋OEC明顯降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 OSCC細胞中TMPRSS11B的mRNA水平降低

2.6 IHC染色法分析TMPRSS11B蛋白在OSCC中的表達情況 IHC 結(jié)果顯示，OSCC 組織中TMPRSS11B 蛋白的染色強度和陽性染色面積的乘積低于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.0001））（表1），IHC評分如圖8A 所示。TMPRSS11B 蛋白免疫組化染色主要見于細胞質(zhì)，在正?？谇簧掀じ鲗颖磉_明顯，多呈深黃或黃棕色著色，在基底層和棘層著色尤深。這與在OSCC 細胞中呈鮮明對比，后者著色率較之少，且多呈淡黃色或無著色(圖8B)。

圖8 TMPRSS11B蛋白在OSCC中的表達情況

表1 OSCC組織和癌旁組織中TMPRSS11B表達情況

表1 OSCC組織和癌旁組織中TMPRSS11B表達情況

2.7 TMPRSS11B蛋白表達與OSCC臨床病理特征的關(guān)系 基于IHC 染色評分，將OCSS 患者分為兩組，TMPRSS11B 高表達組和TMPRSS11B 低表達組。進一步分析TMPRSS11B蛋白表達水平與臨床特點的相關(guān)性。結(jié)果顯示，TMPRSS11B 蛋白表達與OSCC 腫瘤分級相關(guān)，且TMPRSS11B 蛋白表達越低，分化趨勢越差(P＜0.05) ；TMPRSS11B蛋白水平與OSCC 患者的年齡、性別、TMN 分期和腫瘤直徑無明顯關(guān)系(P＞0.05)，見表2。

表2 TMPRSS11B與OSCC患者臨床病理特征中的關(guān)系

3 討論

OSCC是一種侵襲性腫瘤，初期病灶小，通常無癥狀，65%的OSCC是在晚期確診的[15]。OSCC患者的5 年生存率約50%，因為口腔中淋巴管豐富且吻合較多等原因，25%～50%的患者在術(shù)后依然復(fù)發(fā)和遠端轉(zhuǎn)移[16]。因此，OSCC 的早期診斷十分重要。此外，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等手段在治療的同時也給患者的機體功能和頜面部美觀帶來不可逆轉(zhuǎn)的損害，嚴重影響患者生活質(zhì)量，基因靶向治療的研究由此趨于熱門，尋找靶向治療基因也為OSCC 的治療開啟了新思路[17]。

口腔覆蓋的復(fù)層鱗狀上皮依賴于基底細胞增殖，在向外移動到外表面的過程中，經(jīng)歷復(fù)雜的分化過程，產(chǎn)生棘層、顆粒層、角化層，最終脫落[18]。良好的分化是上皮屏障形成的關(guān)鍵，有研究表明，TTSPs 在人類鱗狀上皮中過表達，并在上皮屏障形成中誘導(dǎo)細胞分化[19]。Miller等[11]的組織陣列分析顯示，TMPRSS11B 在鱗狀上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中丟失，提示TMPRSS11B 的可能通過參與分化過程調(diào)控癌癥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OSCC 細胞中TMPRSS11B 的mRNA 水平較正?？谇患毎抡{(diào)。TMPRSS11B 蛋白在OSCC 組織中低表達，在正常口腔上皮層尤其是基底層和棘層高表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)TMPRSS11B 蛋白表達與腫瘤分級相關(guān)。在低分化的OSCC 組織中，免疫陽性細胞百分比和染色程度較低，提示TMPRSS11B 的丟失可能與口腔鱗狀上皮在癌變過程中脫分化有關(guān)。

TMPRSS11B 的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)顯示，SERPINB13、USP26 等為TMPRSS11B 的互作基因。已有研究表明，這些TMPRSS11B 互作基因與多種癌癥的分化和腫瘤形成相關(guān)[20-21]。GO 富集分析示，TMPRSS11B 及其互作基因富集在角化細胞分化，角化作用、上皮細胞分化等生物過程，和胞外外泌體、角質(zhì)化胞膜等細胞組分上，從而有可能因表達失調(diào)影響細胞分化和上皮屏障形成。KEGG通路富集結(jié)果示，TMPRSS11B 及其互作基因在OSCC 可能通過代謝途徑、花生四烯酸代謝和PPAR 信號通路等分子機制，作用于癌癥的臨床表現(xiàn)和預(yù)后。Updegraff 等[12]曾指出，TMPRSS11B 在肺癌中促進乳酸輸出和糖酵解代謝。TMPRSS11B在人肺鱗狀細胞癌(human lung squamous cell carcinomas,LSCCs)中上調(diào)，并促進肺癌的發(fā)生。這與其在鱗狀細胞癌中已經(jīng)過驗證的表達下調(diào)和的抑癌作用相反[11]，也與本研究結(jié)果相反，可能是TMPRSS11B 在不同的癌種起著不同的作用。

早期診斷是OSCC有效治療的關(guān)鍵。在本研究中，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TMPRSS11B的表達與OSCC的預(yù)后和診斷有關(guān)。但由于本研究進行的試驗較少，有一定的局限性，需要更大樣本量的臨床數(shù)據(jù)和實驗驗證才能得出可靠的結(jié)論。此外，TMPRSS11B 調(diào)控OSCC 發(fā)生發(fā)展的確切機制尚未被揭示。對TMPRSS11B的進一步研究有助于確定其作為OSCC 惡性腫瘤評估的分子標志物的作用。TMPRSS11B 靶基因的研究可能為OSCC 的治療開辟新的途徑。