干旱脅迫下枯草芽孢桿菌對(duì)玉米種子抗旱性及生理指標(biāo)的影響

李 安 舒健虹 劉曉霞 蒙正兵 王小利 趙德剛

（1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（農(nóng)業(yè)生物工程研究院）/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，550025，貴州貴陽(yáng)；2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，550006，貴州貴陽(yáng)）

玉米是我國(guó)重要的糧飼作物，可作為工業(yè)原料、食品和牲畜飼料，在糧飼生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用，所以玉米產(chǎn)量影響著國(guó)家糧食安全。玉米對(duì)水分敏感，水分已成為制約玉米產(chǎn)量的重要生態(tài)因子，而對(duì)于多數(shù)作物而言，干旱脅迫反應(yīng)敏感的關(guān)鍵時(shí)期都是芽苗期[1]，干旱脅迫下往往能造成作物種子幼苗的根系、葉片等形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化，出現(xiàn)葉面積減小、植株變矮的現(xiàn)象，從而使玉米生長(zhǎng)不足、產(chǎn)量低[2]，所以提高玉米抗逆性是提高產(chǎn)量的有效方式。研究表明，依賴植物的根際促生菌（PGPR）可以增強(qiáng)作物的抗逆性，王孝先等[3]對(duì)砂生槐根際促生菌的篩選及干旱脅迫對(duì)其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的研究表明，接種菌株的促生效果優(yōu)良，同時(shí)又增強(qiáng)了種子抗旱性?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis）屬PGPR，其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，可用來(lái)研究PGPR與植物的共生關(guān)系?？莶菅挎邨U菌應(yīng)用于植物病害生物防治的研究已經(jīng)有多年歷史，目前在黃瓜[4-5]、辣椒[6-7]、水稻[8-9]、小麥[10-12]和玉米[13-15]等作物病害上表現(xiàn)出較好的防治效果[15]。近年來(lái)，科學(xué)家們從枯草芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的類型、分子作用機(jī)理及田間應(yīng)用等方面開(kāi)展了廣泛而深入的研究，為進(jìn)一步明確枯草芽孢桿菌的作用機(jī)制和作用效果提供了科學(xué)依據(jù)?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的細(xì)胞素對(duì)霉菌和酵母細(xì)菌有一定的抑制作用；其產(chǎn)生的酶類可以消解病原菌的細(xì)胞壁；以及活性蛋白質(zhì)能夠溶解細(xì)胞壁，造成菌絲畸形，孢子不發(fā)芽或者異常[15]。與此同時(shí)，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生生長(zhǎng)激素，如生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯等，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，繼而改善農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。利用植物激素是調(diào)控植物抗旱能力的手段之一[18]。因此，研究干旱脅迫下枯草芽孢桿菌菌種對(duì)玉米萌發(fā)的生理調(diào)節(jié)作用對(duì)于生物菌肥的開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米種子為金玉818，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所提供，枯草芽孢桿菌菌種為貴州省野外采集實(shí)驗(yàn)室保存（表1）。

表1 試驗(yàn)菌種來(lái)源及編號(hào)Table 1 Source and number of tested bacteria

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備 將 4個(gè)菌種培養(yǎng)擴(kuò)增，調(diào)節(jié)OD600值至0.9左右，離心，取沉淀用于菌種試驗(yàn)。

1.2.2 種子預(yù)處理 將玉米種子用10%次氯酸鈉溶液消毒20min，再用無(wú)菌水洗滌3～5遍，自然晾干后備用。

1.2.3 試驗(yàn)處理 設(shè)置10個(gè)處理，分別為20mL無(wú)菌水+菌種（編號(hào)A1、B1、C1、D1）、20mL 15%PEG+菌種（編號(hào)A2、B2、C2、D2）以及20mL無(wú)菌水（CK1）和20mL 15% PEG（CK2）。準(zhǔn)備鋪有2張濾紙的滅菌培養(yǎng)皿，取45粒外觀均勻良好的玉米種子置于上述培養(yǎng)皿中。每個(gè)處理 3次重復(fù)，從處理時(shí)間起，每日記錄發(fā)芽數(shù)，直至不再發(fā)芽為止。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

自播種起每日記錄發(fā)芽數(shù)以及發(fā)霉數(shù)，發(fā)芽結(jié)束后，測(cè)定根長(zhǎng)、根數(shù)、幼苗鮮重、根鮮重、芽鮮重、總生物量、根冠比等發(fā)芽指標(biāo)，然后放置于烘箱 105℃烘 24h，稱量芽與根干重。測(cè)定相對(duì)含水量、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)，同時(shí)測(cè)定芽葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）和葉片游離脯氨酸（Pro）含量。

計(jì)算公式：發(fā)芽率（GR）=7d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)；發(fā)芽勢(shì)（GP）=3d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)；發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ(Gt/Dt)，Gt為第t天發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)；活力指數(shù)（VI）=GI×SL；SL 為幼苗鮮重；幼苗含水量（%）=（SL-G）/SL×100，G為幼苗干重；

采用SOD抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法[19]測(cè)定 SOD活性；采用紫外吸收法[20]測(cè)定 CAT活性；采用磺基水楊酸法[21]測(cè)定Pro含量；采用硫代巴比妥酸法[22]測(cè)定MDA含量；采用愈創(chuàng)木酚法[23]測(cè)定POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用下列公式計(jì)算隸屬函數(shù)值、抗旱性量度值和加權(quán)抗旱指數(shù)。

隸屬函數(shù)值：

標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)：

權(quán)重系數(shù)：

抗旱指數(shù)：

抗旱性量度值：

式中，Xij和Xj分別表示第i處理第j個(gè)指標(biāo)的隸屬值和所有株系第j個(gè)指標(biāo)的平均值；Xmin和Xmax分別表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值和最大值；m與n分別表示指標(biāo)的個(gè)數(shù)和處理數(shù)。耐旱系數(shù)（PI）=不同處理下測(cè)定平均值/對(duì)照測(cè)定值；計(jì)算隸屬函數(shù)值時(shí)，指標(biāo)與耐旱性呈正相關(guān)時(shí)使用公式(1)，指標(biāo)與耐旱性呈負(fù)相關(guān)時(shí)用公式(2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米種子萌發(fā)及幼苗含水量的影響

由表1可知，除B1外，正常無(wú)干旱脅迫下，各菌液處理下發(fā)芽率均顯著高于CK1，B1處理下種子發(fā)芽指數(shù)以及A1活力指數(shù)顯著低于CK1，其余發(fā)芽指標(biāo)均與CK1差異不顯著。干旱脅迫下，各菌液處理發(fā)芽勢(shì)均顯著高于CK2，除B2處理，其余各處理發(fā)芽率均顯著高于CK2，A2發(fā)芽指數(shù)顯著高于CK2。在活力指數(shù)方面，D2活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他處理，其余各處理間差異不顯著，各處理幼苗含水量差異不顯著。干旱處理萌發(fā)指標(biāo)較正常情況有不同程度降低。

2.2 干旱脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米發(fā)芽指標(biāo)的影響

由表3可知，與CK1相比，B1、C1和D1處理下的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根數(shù)、總生物量干重、芽干重和芽鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)顯著提高，根冠比顯著降低，根干重差異不顯著；B1、C1處理下，根鮮重顯著高于CK1，A1處理根干重和根冠比顯著低于CK1。干旱脅迫下，D2處理下玉米根長(zhǎng)、總生物量干重、芽干重與根鮮重均顯著高于CK2，A2、B2和C2處理的根長(zhǎng)與CK2之間差異不顯著。B2、C2和D2處理的芽長(zhǎng)、根數(shù)、根干重與根冠比等萌發(fā)期生長(zhǎng)指標(biāo)與CK2差異不顯著，而A2處理下芽長(zhǎng)顯著低于CK2。整體來(lái)說(shuō)，不同枯草芽孢桿菌處理對(duì)玉米萌發(fā)期相關(guān)指標(biāo)存在不同的影響，其中D2處理有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

表2 不同處理對(duì)玉米種子萌發(fā)及幼苗含水量的影響Table 2 Effects of different treatments on seeds germination and seedling water contents of maize

表3 不同處理對(duì)玉米生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)影響Table 3 Effects of different treatments on corn related growth indexes

2.3 干旱脅迫下隸屬函數(shù)值和標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法分析

不同菌種處理下，運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)公式對(duì)玉米種子萌發(fā)過(guò)程中的抗旱性各指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并且利用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法對(duì)各指標(biāo)賦予權(quán)重，從而定量地比較株系間的抗旱能力。由表4可知，各菌種處理下玉米萌發(fā)過(guò)程抗旱性為D2＞B2＞C2＞A2＞CK2。進(jìn)一步對(duì)D值和各發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表5）顯示，D值與玉米萌發(fā)活力指數(shù)、根長(zhǎng)、幼苗含水量等指標(biāo)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，除根干重與根冠比外與其他指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系。由此，D值既考慮各指標(biāo)的重要性，又考慮了各指標(biāo)間的相互關(guān)系，因此，用D值綜合評(píng)價(jià)抗旱性較為全面和準(zhǔn)確。

表4 干旱脅迫下玉米萌發(fā)抗旱綜合評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive evaluation of maize germination drought resistance under drought stress

表5 干旱脅迫下玉米萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of maize germination indexes under drought stress

2.4 干旱脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中SOD、CAT和POD活性的影響

由圖1所示，與非干旱脅迫相比，干旱脅迫下玉米萌發(fā)過(guò)程中的抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性都呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，而干旱脅迫與非干旱脅迫接種枯草芽孢桿菌菌體顯著降低了SOD、CAT和POD的活性。值得注意的是，干旱脅迫與非干旱脅迫接種菌劑對(duì)于POD活性的影響較小，其中B與D干旱脅迫處理下顯著降低了POD活性，而接種菌劑處理下，SOD和CAT活性都呈現(xiàn)出顯著降低的趨勢(shì)。這表明干旱脅迫下玉米抗氧化酶SOD、CAT和POD活性都得到提高以應(yīng)對(duì)干旱對(duì)植物的損傷，接種菌劑降低了干旱脅迫對(duì)酶活性的影響。

圖1 不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中SOD、CAT及POD活性的影響Fig.1 Effects of different strains treatments on the activities of SOD, CAT and POD during corn germination

2.5 干旱脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中滲透物質(zhì)Pro含量的調(diào)節(jié)

干旱脅迫與非脅迫下及不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中滲透物質(zhì)Pro含量的調(diào)節(jié)存在差異。由圖2a所示，干旱脅迫下，玉米萌發(fā)過(guò)程中芽尖 Pro含量明顯提高以增加細(xì)胞內(nèi)滲透物質(zhì)含量，防止細(xì)胞內(nèi)水分子的流失。其中接種枯草芽孢桿菌 D的玉米芽尖 Pro含量顯著高于對(duì)照組與其余各枯草芽孢桿菌處理，而在非脅迫下除接種枯草芽孢桿菌A以外，其余各菌株均能提高玉米芽尖的Pro含量。

2.6 干旱脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中MDA含量的調(diào)節(jié)

如圖2b所示，干旱脅迫與非脅迫下不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中滲透物質(zhì)Pro和芽尖MDA含量的調(diào)節(jié)趨勢(shì)并不一致，在非干旱脅迫下，接種枯草芽孢桿菌的A1、B1和C1處理顯著高于對(duì)照組玉米芽尖的MDA含量。值得注意的是，接種枯草芽孢桿菌D顯著提高了玉米芽尖的Pro含量，但玉米芽尖的MDA含量與對(duì)照組差異并不顯著，且低于接種A、B和C菌種。在干旱脅迫下，對(duì)照組MDA含量顯著高于接種枯草芽孢桿菌的處理，其中接種D菌種的處理顯著低于其余各處理。整體而言，干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌降低了玉米芽尖的MDA含量，其中接種枯草芽孢桿菌D的下降幅度最大。

圖2 不同菌種處理對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程中滲透物質(zhì)Pro與MDA含量的影響Fig.2 The effects of different strain treatments on the contents of osmotic substance Pro and MDA during corn germination period

3 討論

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和種子活力指數(shù)反映植物種子發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的趨勢(shì)，常作為評(píng)價(jià)種子發(fā)芽的指標(biāo)[24]。本研究表明，接種枯草芽孢桿菌能夠提高玉米發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)，不同菌種處理具有一定差異。C菌種處理能夠提高玉米種子的發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)；干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌A有利于提高玉米種子發(fā)芽指數(shù)，而接種枯草芽孢桿菌D有利于提高其活力指數(shù)。根系是植物吸收水分的最主要的器官，對(duì)外界環(huán)境水分的變化反應(yīng)極為敏感，水分脅迫下根系形態(tài)會(huì)發(fā)生變化。本試驗(yàn)中測(cè)定干旱脅迫與非脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)期的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根鮮重、芽鮮重、根干重和芽干重等發(fā)芽指標(biāo)，并對(duì)玉米各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行干旱脅迫下隸屬函數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法分析，將不同的發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行綜合運(yùn)算，通過(guò)其結(jié)果加權(quán)抗旱指數(shù)、隸屬函數(shù)均值、D值，從而綜合評(píng)價(jià)干旱脅迫與非脅迫下接種不同枯草芽孢桿菌菌種對(duì)玉米萌發(fā)的影響。此方法在魏波等[25]進(jìn)行的 PEG模擬干旱條件下紅花種子萌發(fā)特性的比較研究中用到。D值是對(duì)各個(gè)玉米發(fā)芽指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，并通過(guò)D值與玉米各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)D值與玉米萌發(fā)活力指數(shù)、根長(zhǎng)、根數(shù)等指標(biāo)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與其他指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系。而根據(jù)加權(quán)抗旱指數(shù)、隸屬函數(shù)均值和D值的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果可知，干旱脅迫下，各菌種處理玉米萌發(fā)過(guò)程抗旱性為D2＞B2＞C2＞A2＞CK2，干旱脅迫環(huán)境下接種枯草芽孢桿菌提高了玉米種子萌發(fā)過(guò)程中的抗逆性。

干旱脅迫下，植物會(huì)因缺水而受到傷害，甚至死亡。為了適應(yīng)或抵抗缺水的不利環(huán)境，植物形成了從表型特征變化、生理生化響應(yīng)等應(yīng)激方式來(lái)維持自身的水分狀況，以避免或減輕缺水對(duì)植物的傷害[26]。從形態(tài)上具體表現(xiàn)為植株矮化、葉片角質(zhì)層增厚、氣孔下陷、氣孔關(guān)閉、根系更為發(fā)達(dá)、根冠比增高、蒸騰面積減??；植物通過(guò)表型特征變化有效增加水分吸收量，同時(shí)降低水分散失；生理生化響應(yīng)機(jī)制可分為2類，一是通過(guò)積累可溶性糖、可溶性蛋白、Pro等滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，防止水分子的損失，同時(shí)能量消耗也降低，使植物抗逆性增強(qiáng)，這是植物適應(yīng)干旱脅迫的重要方式[27-29]。本研究中干旱與非干旱脅迫下接種不同枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)過(guò)程中Pro的積累結(jié)果顯示，接種枯草芽孢桿菌在干旱與非干旱脅迫下都提升了Pro的含量，且干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)過(guò)程中Pro的積累情況與抗旱評(píng)價(jià)相印證，即D2＞B2＞C2＞CK2；二是干旱脅迫下，植物抗逆性增強(qiáng)同時(shí)還表現(xiàn)在植物非酶促反應(yīng)與酶促反應(yīng)方面。酶促反應(yīng)系統(tǒng)主要為SOD、POD和CAT等一系列復(fù)雜的過(guò)程與酶調(diào)控植物體內(nèi)活性氧代謝維持著動(dòng)態(tài)平衡[30-31]。作為系統(tǒng)性的調(diào)節(jié)，單一的抗氧化酶或抗氧化物并不足以防御活性氧脅迫對(duì)植物的傷害，它們需要協(xié)同作用以共同抵抗干旱脅迫引起的氧化傷害。在干旱脅迫下，抗旱性強(qiáng)的植物體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性一般較高，因而能夠有效清除植物體內(nèi)活性氧，抑制膜脂過(guò)氧化，緩解植物因干旱脅迫受到的傷害。雖然發(fā)現(xiàn)干旱脅迫與抗氧化酶活性之間存在顯著的相互作用，但PGPR菌株處理往往會(huì)降低干旱脅迫對(duì)酶活性的影響[32]。在枯草芽孢桿菌處理下，玉米種子SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性降低。干旱與非干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌的玉米芽尖 SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性變化一致。

通過(guò)測(cè)定 MDA含量可判斷植物細(xì)胞受脅迫損傷程度，MDA是膜脂過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物，可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞以及功能的喪失。干旱條件下，MDA含量會(huì)隨著脅迫程度加重而增加是判斷植物抗旱性的重要指標(biāo)[33-34]。本試驗(yàn)在干旱與非干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌，通過(guò)測(cè)定玉米芽尖的MDA含量，發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌的玉米在非脅迫下與對(duì)照組差異較小，且各處理間差異也較小。但是干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌使玉米芽尖MDA含量有顯著性的降低，其中接種枯草芽孢桿菌D的玉米芽尖MDA含量最低，體現(xiàn)出接種枯草芽孢桿菌能夠提高玉米在干旱脅迫下的抗逆性。

4 結(jié)論

各菌種處理下玉米萌發(fā)過(guò)程抗旱性表現(xiàn)為R60＞R9-1＞R59＞R29-1＞CK2。接種枯草芽孢桿菌能提升玉米萌發(fā)過(guò)程的Pro含量，降低抗氧化酶SOD、CAT和POD活性，同時(shí)能夠有效減輕細(xì)胞膜受到的傷害，尤其接種枯草芽孢桿菌 R60效果更加顯著。選擇何種菌種進(jìn)行微生物菌肥的生產(chǎn)需要對(duì)玉米生長(zhǎng)各生育時(shí)期進(jìn)行研究，從而優(yōu)選出更利于玉米產(chǎn)量增加的菌種。