雙重檢測馬鈴薯X和Y病毒試紙條制備技術(shù)研究

張 微 李志新 趙 雪 張金鵬 付春江 于倩倩 劉衛(wèi)平

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，161600，黑龍江齊齊哈爾）

馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）是馬鈴薯最常見的病毒之一，其感染癥狀是葉片變小，花葉、葉片上有大小不等的黃綠色斑駁等，可使馬鈴薯產(chǎn)量降低10%～50%。馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是危害馬鈴薯、煙草等茄科植物的主要病毒之一，其感染癥狀是重花葉、葉脈壞死和出現(xiàn)褐斑等，可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn) 20%～50%。在田間，PVX與PVY常復(fù)合侵染，造成馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)。我國馬鈴薯生產(chǎn)受病毒病危害非常嚴(yán)重，在各主要產(chǎn)區(qū)如黑龍江、河南等地多為復(fù)合侵染[1-3]。目前，馬鈴薯感染病毒后主要通過電子顯微鏡、DAS-ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和PCR等方法[4-6]進(jìn)行檢測，但此類方法在生產(chǎn)上的應(yīng)用具有很大局限性[7]。膠體金免疫層析技術(shù)（gold immunochromatography assay，GICA）是將膠體金標(biāo)記、免疫檢測、層析分析、單（多）克隆抗體和新材料等結(jié)合在一起的技術(shù)，具有操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)[8]，在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-12]。在馬鈴薯上已研制出 PVX和PVY單重膠體金檢測試紙條[13]。目前，多重馬鈴薯病毒的檢測多使用分子生物學(xué)方法[14]，而關(guān)于多重馬鈴薯病毒膠體金檢測試紙條的研究尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)研制定性檢測PVX和PVY的雙重膠體金試紙條，為馬鈴薯病毒病的田間檢測提供一種快速的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PVX和 PVY為本研究室從馬鈴薯上分離得到。病毒分別摩擦接種繁殖于心葉煙（Nicotiana glutinosa）上。馬鈴薯 S病毒（PVS）、卷葉病毒（PLRV）、M病毒（PVM）和A病毒（PVA）為本研究室保存。供試馬鈴薯品種為克新13號。

1.2 試劑和儀器

PVX和PVY兔多克隆抗體購買于美國Agida公司，羊抗兔抗體購自北京百奧萊博科技有限公司，氯金酸購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，檸檬酸三鈉和牛血清白蛋白購自上?；菔烙邢薰?，硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水紙、支持板、三維大平面點(diǎn)膜噴金儀、裁條機(jī)和微電腦自動斬切機(jī)均購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。DASELISA檢測試劑盒購買于美國Agida公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 膠體金的制備和鑒定

采用常規(guī)的氯金酸－檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取297mL ddH2O于圓底燒瓶中，加入3mL 1% HAuCl4·4H2O混勻。將圓底燒瓶置于電熱套式恒溫器中，加入干凈攪拌子，低速攪拌加熱至沸騰，迅速一次性加入3mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，觀察顏色變化為淺黃色→黑色→紫色→紫紅色，當(dāng)完全轉(zhuǎn)變成紅色時(shí)，繼續(xù)煮沸5min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積。將燒制的膠體金溶液用蛋白核酸分析儀（Gene Spec V，日本日立）進(jìn)行全波長掃描鑒定，并置于透射電鏡（H7650，日本日立）下觀察拍照[15]。

1.4 免疫膠體金試紙條制備工藝優(yōu)化

主要對金標(biāo)抗體的標(biāo)記量、反應(yīng) pH、封閉時(shí)間、離心時(shí)間、復(fù)溶液和復(fù)溶量等進(jìn)行優(yōu)化。取8支干凈的1.5mL離心管，分別加入1mL膠體金，然后分別加入4μL 1mg/mL PVX與PVY抗體，再分別加入 1、2、3、4、5、6、7、8μL 的 0.2mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH，混勻后室溫靜置反應(yīng)30min，觀察顏色變化。根據(jù)顏色結(jié)果確定免疫膠體金的最適pH。另取8支干凈的1.5mL離心管，分別加入1mL膠體金，然后分別加入已確定的最適 pH對應(yīng)的0.2mol/L K2CO3的加入量，再分別加入1、2、3、4、5、6、7和8μL的1mg/mL PVX與PVY抗體，來調(diào)節(jié)抗體標(biāo)記量，混勻后室溫靜置反應(yīng)30min，觀察沉淀變化。根據(jù)沉淀結(jié)果確定免疫膠體金的最適抗體標(biāo)記量。標(biāo)記了膠體金后的抗體加入 10%BSA，分別設(shè)置封閉時(shí)間 10、20、30、40、50和60min，觀察加入封閉劑后顏色變化，根據(jù)顏色變化選擇顏色恢復(fù)成膠體金顏色1時(shí)為最佳封閉時(shí)間，設(shè)置離心時(shí)間10、20、30、40、50和60min，留沉淀?xiàng)壣锨澹x擇沉淀量最多、沉淀效果最好的為最佳離心條件。分別用復(fù)溶液50、60、70、80、90、100、110和 120μL復(fù)溶沉淀至合適的比例，用噴金儀器設(shè)置噴金量3、4、5、6、7、8和9μL/cm，選擇反應(yīng)顏色容易觀察的噴金量為最佳，噴在玻璃纖維紙上，制作金標(biāo)墊。

1.5 檢測線和質(zhì)控線

將PVX與PVY抗體分別用超濾管（Millipore，10kD）進(jìn)行濃縮。將硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane，NC膜）固定貼合于支持板上，使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀分別將PVX抗體和PVY抗體濃度設(shè)置為 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mg/mL，并劃線于NC膜上，作為檢測線（testline，T線），T1線為PVX檢測線，T2線為PVY檢測線。用0.02mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB，pH 7.4）將羊抗兔抗體稀釋至0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mg/mL，劃線于NC膜上，作為質(zhì)控線（control line，C線），37℃烘干4h。選擇反應(yīng)條帶顏色可觀察到的最低抗體使用量為最佳。

1.6 試紙條的組裝

將樣品墊、金標(biāo)墊和吸水紙組裝到附有NC膜的支持板上，然后用切條機(jī)切割成 3.5mm寬的試紙條。

1.7 試紙條的質(zhì)量檢測

1.7.1 特異性檢測 分別將PLRV與PVS、PVA與PVM、PVM與PVS、PVX與PVA、PVY與PVA、PVX與PVY病毒的陽性材料用2mL的磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）混勻，制成樣品檢測液，將制備好的試紙條置于樣品中檢測，每2種病毒混合液重復(fù)檢測3次。

1.7.2 靈敏度檢測 取PVX和PVY陽性混合樣品進(jìn)行倍比稀釋獲得 1、10、102、103、104、105、106和107倍的樣品稀釋液，分別用試紙條進(jìn)行靈敏度檢測。

1.7.3 準(zhǔn)確性檢測 分別取馬鈴薯待檢樣品93份，分別采用膠體金試紙條與DAS-ELISA進(jìn)行檢測，將結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.7.4 穩(wěn)定性測試 將試紙條放在裝有干燥劑的鋁箔袋中，分別密封保存在4℃冰箱中、室溫下和敞開保存在室溫下；設(shè)置不同保存時(shí)間，利用陰性樣品、只含有PVX、只含有PVY和同時(shí)含有PVX和PVY的陽性材料定期檢測試紙條的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金顆粒觀測

制備好的膠體金在波長 526nm處有最大吸收峰（圖1），金顆粒為圓形，直徑20～30nm（圖2），表明膠體金質(zhì)量較好，符合免疫層析試驗(yàn)要求。

圖1 膠體金吸收光譜Fig.1 Colloidal gold absorption spectrum

圖2 透射電鏡下膠體金顆粒形態(tài)（Bar=500nm）Fig.2 Colloidal gold particle morphology under transmission electron microscope (Bar=500nm)

2.2 膠體金試紙條制備條件優(yōu)化

制備金標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)條件為加入 2μL 0.2mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH，PVX抗體加入量為4μL，PVY抗體加入量為5μL，封閉時(shí)間40min，離心時(shí)間30min，100μL復(fù)溶液復(fù)溶沉淀。膠體金噴涂量為6μL/cm，T1線的PVX抗體濃度為1mg/mL，T2線的PVY抗體濃度為1.2mg/mL，C線的羊抗兔抗體濃度為1mg/mL，檢測線T1、T2與C線劃膜量均為1μL/cm。

2.3 試紙條特異性檢測

由圖3可知，將試紙條分別插入PVX陽性樣品與 PVY陽性樣品中，相應(yīng)病毒的檢測線及質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶；2種病毒陽性樣品混合后，將試紙條插入混樣后，2條檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)明顯條帶；將試紙條分別插入PLRV、PVS、PVM、PVA的陽性樣品中，僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，說明本試紙條具有非常好的特異性。

圖3 試紙條對6種常見病毒的特異性檢測Fig.3 Specific detection of six common viruses by strips

2.4 試紙條靈敏度檢測

分別將試紙條插入稀釋1、10、102、103、104、105、106和107倍的PVX和PVY陽性樣品中檢測其靈敏度。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，試紙條可檢測稀釋至106倍的PVX汁液和105倍PVY汁液。

圖4 試紙條檢測PVX和PVY汁液Fig.4 Test strips detect PVX and PVY sap

2.5 試紙條與DAS-ELISA檢測馬鈴薯苗帶毒情況一致性分析

由表1可知，雙重病毒試紙條檢出PVX陽性樣品12份，PVY陽性樣品26份，其中 PVX和PVY同時(shí)侵染樣品8份，而DAS-ELISA檢出PVX陽性樣品14份，PVY陽性樣品29份，其中PVX和PVY同時(shí)侵染樣品9份。

表1 2種方法檢測結(jié)果Table 1 The results of two methods

如表2所示，比對雙重病毒檢測試紙條和DASELISA檢測樣品結(jié)果，得出2種方法對PVX的檢測符合率為97.85%，Kappa值為0.91，判定2種方法符合率非常高；比對雙重病毒檢測試紙條和DAS-ELISA檢測樣品結(jié)果，得出2種方法對PVY的檢測符合率為96.77%，Kappa值為0.92，可見2種方法對PVY檢測符合率非常高。

表2 雙重病毒檢測試紙條與DAS-ELISA檢測PVX和PVY的符合性對比Table 2 Comparison of the compatibility between the double virus test strip and DAS-ELISA test for PVX and PVY

2.6 試紙條穩(wěn)定性檢測

如圖5所示，將試紙條放在裝有干燥劑的鋁箔袋中密封，放在4℃冰箱中保存，有效期可達(dá)210d，能夠保持原有靈敏度；試紙條密封后室溫保存，有效期大于120d，檢測靈敏度有所下降；試紙條在室溫下敞開保存，30d就失去了檢測能力。說明在適當(dāng)條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 試紙條穩(wěn)定性測試結(jié)果Fig.5 Stability test results of strip

3 討論

有研究[1,16]表明，2種及以上不相關(guān)的病毒復(fù)合侵染同一寄主是病毒侵染過程中的常見現(xiàn)象。由于復(fù)合侵染時(shí)2種病毒的相互作用，包括協(xié)生（增加病毒含量）或拮抗（減少病毒含量），會導(dǎo)致寄主產(chǎn)生的癥狀與單獨(dú)侵染不同。PVX復(fù)合侵染比單獨(dú)侵染時(shí)復(fù)制能力增強(qiáng)，病毒含量大幅提高，并造成癥狀加重，因此對復(fù)合侵染病毒的檢測方法尤其重要。已有研究[14,17]表明，通過電鏡手段和PCR技術(shù)可以對PVX和PVY復(fù)合侵染進(jìn)行檢測。對多種在煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和PVY上病毒檢測試紙條已有研究[18]，對3種病毒的特異性、靈敏度和一致性進(jìn)行了研究分析，但是試紙條的檢測時(shí)間與穩(wěn)定性沒有提及。對于PVX和PVY雙重病毒試紙條研究目前沒有相關(guān)報(bào)道。PVX和PVY是最常見、同時(shí)也是對馬鈴薯危害最嚴(yán)重的2種病毒，常規(guī)的檢測方法只能在實(shí)驗(yàn)室由專業(yè)技術(shù)人員操作完成，給需要隨時(shí)檢測馬鈴薯病毒發(fā)生情況的田間及試驗(yàn)條件差的基層單位造成不便。而試紙條檢測具有使用方便、反應(yīng)快捷的特點(diǎn)。經(jīng)過田間取樣測試，本試紙條與DAS-ELISA檢測結(jié)果吻合性非常高，雙重病毒試紙條的陽性檢出率稍低于DAS-ELISA，可能是由于試紙條檢測靈敏度低于DAS-ELISA，但也不排除DAS-ELISA出現(xiàn)假陽性的可能[19-20]。已有研究[15]表明，單一檢測PVX和PVY的試紙條檢測樣品的反應(yīng)時(shí)間在10min之內(nèi)；馬鈴薯X病毒試紙條檢測煙草病汁液可稀釋104倍（W/V），馬鈴薯Y病毒試紙條檢測煙草病汁液可稀釋103倍；低溫保存時(shí)間大于90d，室溫保存時(shí)間大于30d。本試紙條檢測反應(yīng)快捷，約2min就能得出結(jié)果，節(jié)約了檢測時(shí)間。相對于單一檢測PVX和PVY試紙條，節(jié)約了部分成本。對PVX試紙條檢測病毒汁液可稀釋106倍（W/V）；PVY試紙條檢測病汁液可稀釋105倍，提高了檢測靈敏度。低溫4℃保存時(shí)間超過210d，室溫密封保存時(shí)間可達(dá)120d，穩(wěn)定性顯著提高。雙重病毒試紙條的檢測效果基本能夠滿足田間及口岸一線的檢測需求。

4 結(jié)論

PVX和PVY雙重病毒試紙條具有使用方便、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，無需實(shí)驗(yàn)室及專業(yè)技術(shù)人員，隨時(shí)隨地均可以操作使用，而且反應(yīng)快捷，幾分鐘出結(jié)果，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場取樣現(xiàn)場出結(jié)果，實(shí)用性強(qiáng)，適用性廣。特別適用于馬鈴薯田間和試驗(yàn)基礎(chǔ)條件差的單位使用。實(shí)現(xiàn)了一個(gè)試紙條對PVX和PVY同時(shí)快速檢測，不僅提高了檢測效率，且節(jié)約了部分成本，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。