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      鼠李糖乳桿菌Probio-M9的特異性熒光原位雜交探針設(shè)計及應(yīng)用

      2021-12-17 03:59:20徐瑞波高廣琦白曉曄李偉程張和平
      中國食品學(xué)報 2021年11期
      關(guān)鍵詞:鼠李糖探針益生菌

      徐瑞波,高廣琦,白曉曄,李偉程,張和平*

      (1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古乳業(yè)生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018)

      人體腸道是大量活細菌的天然棲息地[1],有超過500 種細菌[2]。研究證實,腸道中生長的正常微生物是腸道的生物屏障[3]。乳酸桿菌是人類結(jié)腸中的常駐菌群,是腸道中的優(yōu)勢細菌[4]。大多數(shù)乳酸菌具有益生功能,被歸類為益生菌[5]。益生菌是一種有益于宿主的細菌,可以促進腸道菌群的生態(tài)平衡[6],有助于增強腸道免疫功能[7],維持腸道膽固醇平衡[7]以及減輕抗生素副作用等功效[8]。

      人體攝入的益生菌通常在腸道中定植。為了檢測益生菌在腸道中的存活和定植,通常使用傳統(tǒng)識別方法和分子生物學(xué)鑒定方法。傳統(tǒng)的識別方法[9]包括形態(tài)學(xué)識別以及生理生化識別[10]。分子生物學(xué)鑒定方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和熒光原位雜交[11]。熒光原位雜交是一種非放射性的原位雜交技術(shù),結(jié)合了熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測方法,可以快速、準確地鑒定樣品中的靶細胞。目前,熒光原位雜交技術(shù)已廣泛用于靶細菌的靶標識別[12]。通過基因組測序,菌株水平特異性探針的開發(fā)可以更準確地定性檢測宿主中的菌株,為益生菌的開發(fā)提供更多的研究證據(jù)。近年來,已開發(fā)出在側(cè)鏈上官能化而無熒光團的D-氨基酸(DAA)的類似物(熒光D-氨基酸,F(xiàn)DAA),用于細菌肽聚糖的代謝標記。此外,F(xiàn)DAA 被用于體內(nèi)微生物標記[13],用于熒光跟蹤和評估移植微生物的生存能力。

      目前,本實驗室已開發(fā)出幾種可食用的益生菌菌株,其中鼠李糖乳桿菌Probio-M9 是從健康母乳中分離得到的[14],具有優(yōu)異的胃腸液耐受性和良好的膽汁鹽耐受性,具有作為益生菌的基本條件,可以改善腸道菌群的多樣性并增強免疫力。為了研究特定菌株在宿主腸中的定植和精確定位,使用熒光原位雜交定位鼠李糖乳桿菌Probio-M9。基于鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的整個基因組序列設(shè)計了菌株特異性探針,并對該探針進行熒光原位雜交測試,以評估和驗證該探針與鼠李糖乳桿菌雜交的特異性和有效性。此外,通過與FDAA 探針雙重測試,在攝入鼠李糖乳桿菌Probio-M9 后大鼠的腸道內(nèi)鑒定到活的鼠李糖乳桿菌Probio-M9,進而定位宿主中的益生菌。

      1 材料與方法

      1.1 細菌菌株的培養(yǎng)

      本研究中使用的細菌菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供,具體信息見表1。

      表1 試驗菌株信息Table 1 Information of main strains in the experiment

      1.2 儀器與試劑

      LSM 900 共焦顯微鏡,卡爾蔡司(上海)管理有限公司;LC-JSY-1 恒溫干式金屬浴高溫加熱振蕩器,湖南力辰儀器科技有限公司。

      本研究所有菌株所用培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基,購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;沒有羧基保護基的FDAA 購自中國多肽公司(中國杭州);帶有羧基保護基的FDAA 探針是由 Scilight Biotechnology(中國北京)定制合成的。

      1.3 大鼠

      10 周大的Wastar SPF 雌性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(中國北京)。所有大鼠均在具有12 h 光照/黑暗周期的溫度控制(24℃)的動物設(shè)施中飼養(yǎng),并接受標準飲食,可以自由享用清潔水。每天早晨更換飼料和水以保持新鮮。每組大鼠單籠飼養(yǎng)。

      1.4 鼠李糖乳桿菌種水平特異性探針(Probe-16S)設(shè)計

      根據(jù)現(xiàn)有的乳桿菌的基因組信息,篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段,根據(jù)鼠李糖乳桿菌的16S 序列設(shè)計了特異性探針[15](5’-CGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACC-3’),并在5’端用6-羧基熒光素(6-FAM)熒光基團修飾。雜交優(yōu)化后,使用鼠李糖乳桿菌的15 個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15 個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15 個代表性菌株測試了探針16S 的特異性(表1)。

      1.5 鼠李糖桿菌Probio-M9 菌株水平特異性探針(Probe-SP)設(shè)計

      根據(jù)現(xiàn)有乳酸桿菌的基因組信息,首先篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段,然后將鼠李糖乳桿菌不同菌株的基因組與Probio-M9 菌株的基因組進行比較和分析,以篩選特異性基因組片段?;谠撈危O(shè)計了Probio-M9 菌株的水平特異性探針(5'-CCAACTGACGCCTTCACTTCG)。使用鼠李糖乳桿菌的15 個代表性菌株和來自乳桿菌的相關(guān)屬的15 個代表性菌株測試探針-SP 的特異性(表1)。

      1.6 熒光原位雜交(FISH)方法

      將要標記的細菌細胞用PBS 洗滌2 次,重懸于500 μL PBS 中,加入等體積的無水乙醇,并在-20 ℃過夜。將細菌溶液以12 000×g離心3 min,除去上清液。然后在37 ℃下用100 μL 工作液(使用Tris-HCl pH 6.5 配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的工作液)處理細胞10 min,離心去除上清液,用PBS洗滌,加入500 μL 雜交緩沖液以及5 μL 探針儲備溶液,46 ℃搖動4 h 雜交,并通過離心除去上清液。加入500 μL 的雜交緩沖液,48 ℃搖動15 min洗滌混合物,通過離心去除上清液[16-17]。

      1.7 特異性Probe-SP 探針體外試驗驗證

      為了測試Probe-SP 在復(fù)雜樣品中的雜交效果,將培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株與大鼠糞便混合,并分別用Probe-16S 和Probe-SP 進行FISH 測試。

      1.8 特異性Probe-SP 探針體內(nèi)試驗驗證

      為了測試Probe-SP 在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下能否特異性雜交到Probio-M9,將12 只Wistar 大鼠分成2 組,分為鼠李糖乳桿菌Probio-M9 組和對照組(n=6)。鼠李糖桿菌Probio-M9 組每天服用Probio-M9(4×109CFU),對照組每天服用生理鹽水。在灌胃第14 天,每組隨機選擇3 只大鼠口服FDAA。灌胃15 d 后處死大鼠,取小腸、盲腸、結(jié)腸和大鼠各部分的內(nèi)容物。使用Probe-SP 對收集的腸組織和內(nèi)容物進行FISH 試驗。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 特異性探針的熒光原位雜交試驗條件優(yōu)化

      通過比較鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和其它鼠李糖乳桿菌的基因組,篩選鼠李糖乳桿菌Probio-M9的特異性序列,并設(shè)計了Probe-SP。特異性探針Probe-SP 和特異性探針Probe-16S 用于與15個鼠李糖乳桿菌菌株和15 個其它乳酸桿菌菌株雜交。試驗結(jié)果表明特異性探針Probe-SP 僅與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 雜交(表1 和圖1),而探針Probe-16S 可與其它鼠李糖乳桿菌雜交。特異性探針Probe-SP 和探針Probe-16S 都不能與其它乳酸桿菌菌株雜交,證明特異性探針Probe-SP 具有特異性。

      圖1 特異探針Probe-SP 對鼠李糖桿菌Probio-M9 的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.1 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP

      探索了一系列條件后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)溶菌酶處理的細胞具有更好的雜交效果,最佳雜交條件為46 ℃處理4 h。

      2.2 特異性Probe-SP 探針體外試驗驗證結(jié)果

      在大鼠糞便中觀察到特異性的培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株雜交(圖2),表明Probe-SP適用于檢測和定量復(fù)雜樣品中的乳酸桿菌物種。

      圖2 特異探針Probe-SP 對鼠李糖桿菌Probio-M9在大鼠糞便中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.2 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP in rat feces

      2.3 特異性Probe-SP 探針體內(nèi)試驗驗證結(jié)果

      從圖3 和4 中可以看出,綠色熒光標記代表鼠李糖乳桿菌Probio-M9,紅色熒光標記代表活菌,紅色和綠色熒光標記代表鼠李糖乳桿菌M9,結(jié)果表明,該方法可以鑒別復(fù)雜樣品中的鼠李糖乳桿菌Probio-M9,為今后益生菌在腸道菌落的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

      圖3 特異探針Probe-SP 和FDAA 探針對鼠李糖桿菌Probio-M9 在大鼠小腸內(nèi)容物中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.3 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat small intestine contents

      圖4 特異探針Probe-SP 和FDAA 探針對鼠李糖桿菌Probio-M9 在大鼠盲腸內(nèi)容物中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.4 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat cecum contents

      3 結(jié)論

      本研究針對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和其它相關(guān)物種的基因組序列,分別設(shè)計了種水平特異性探針(Probe-16S)和菌株水平特異性熒光原位雜交探針(Probe-SP),并通過對15 株鼠李糖乳桿菌菌株和15 株其它益生菌進行探針特異性的驗證;同時結(jié)合熒光D-氨基酸(FDAA)代謝探針,在大鼠的腸道中檢測到鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的活細胞。本方法在在攝入鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株后可利用該探針檢測及定位宿主腸道內(nèi)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9,為以后開發(fā)和利用Probio-M9 提供更多的理論依據(jù)。

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