肝病患者聚合酶鏈反應(yīng)法檢測血中納米細(xì)菌的臨床價值

王 楠

（大連市公共衛(wèi)生臨床中心（大連市第六人民醫(yī)院），遼寧 大連 116031）

納米細(xì)菌是由芬蘭科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)的微小細(xì)菌，經(jīng)過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，它不僅會感染人類，還會感染其他哺乳動物，屬于一種人獸共患的致病原。另外，納米細(xì)菌與人類多種疾病的發(fā)生都有直接關(guān)系，如結(jié)石、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、皮膚病、腫瘤等。有部分國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在人納米細(xì)菌存在的范圍非常廣，健康人的血清中、腎結(jié)石患者的血液、尿液中、肝病血清中等[1]。慢性肝病是我國目前常見的一種疾病，患者免疫力一旦低下就會引起引發(fā)疾病，對患者的生活質(zhì)量和生命安全都造成了嚴(yán)重的影響，所以在該疾病患者中及早檢測出納米細(xì)菌，有助于為治療提供依據(jù)[2-3]。目前對肝病患者開展血清中納米細(xì)菌檢測工作時，通常是采用細(xì)菌培養(yǎng)、免疫組化、電鏡開展檢測工作，但這些方法操作煩瑣，耗時較長[4-5]。而聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）利用特異性熒光TaqMan探針，實行完全閉管式操作，能夠有效減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，在敏感性、特異性與速度方面都有明顯的優(yōu)勢，在臨床檢測中具有很高的應(yīng)用價值。本研究主要開展血中納米細(xì)菌的檢測工作，探討聚合酶鏈反應(yīng)法檢測血中納米細(xì)菌的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年1月至2019年4月入住我院并接受治療的110例肝病患者和40名同時間段接受健康體檢的人員。110例肝病患者中有慢性乙型肝炎35例、慢性丙型肝炎30例，肝炎肝硬化25例，肝癌20例；男女比例為49∶61；年齡18～76歲，平均年齡為（47±29）歲。

1.2 方法

1.2.1 ELASA法 嚴(yán)格按照試劑盒上說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR技術(shù) 將10 μL血清樣本直接到存有10 μL顆粒的PCP反應(yīng)管中，再加入50 μL的裂解液，將其混合均勻。震蕩30 s，之后放置在室溫的后置磁力架上，時間控制在5 min，將顆粒吸附在一側(cè)的管壁上，全部將液相吸棄。將含有顆粒的PCP反應(yīng)管中加入100 μL包被液，放置在渦旋振蕩器上，讓其震30 s，在試管中進(jìn)行常規(guī)靜置，時間控制在30 s，同樣使顆粒吸附在一側(cè)的管壁上，全部將液相吸棄[3]。上游引物（5′-3′）：GGA GGA ACA CCA GTG GCG AAG G；下游引物（5′-3′）：GCC CGT AAG GCA ATG AGG AC；由中國科學(xué)院上海生物工程中心合成,其擴(kuò)增片段的直徑為511 bp，20 μL反應(yīng)體系，Taq酶1 U。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，5 min時直接進(jìn)入循環(huán)，要滿足94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的條件，在循環(huán)35個環(huán)節(jié)下，72 ℃要繼續(xù)進(jìn)行延伸，時間控制在5 min，取出5 μL加入到2%瓊脂糖凝膠電泳中，在長波紫外燈下對肝病患者的情況進(jìn)行觀察。

1.2.3 射電鏡掃描法 在無菌無致熱源條件下，將抗凝血漿取出，劑量為1 mL，之后用生理鹽水進(jìn)行稀釋，依次經(jīng)0.45 μm和0.22 μm濾膜過濾，離心45 min；取管底1 mL混勻，之后加入胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；混勻后,將標(biāo)本放置在溫度為在37 ℃、pH值為7.40%，5%CO2和95%空氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為45 d。取部分納米細(xì)菌的培養(yǎng)物標(biāo)本8 000 r/min離心10 min，置于0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.0）配制的2.50%戊二醛固定液及1.0%四氧化鋨固定液中進(jìn)行雙同定；超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后，在透射電鏡下進(jìn)行觀察、拍照。在培養(yǎng)物的標(biāo)本中可以發(fā)現(xiàn)50 nm左右和較大的細(xì)菌樣顆粒則為陽性，反之為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測納米細(xì)菌陽性率結(jié)果對比 采用ELASA法檢測，肝病患者納米細(xì)菌的總感染率顯著高于健康人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，肝病患者納米細(xì)菌的總感染率與健康人對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；這2種檢測方法檢測肝病患者納米細(xì)菌感染率對比，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種檢測納米細(xì)菌陽性率結(jié)果對比（）

表1 兩種檢測納米細(xì)菌陽性率結(jié)果對比（）

注：與健康人相比，aP＜0.05。

2.2 ELASA法及PCR技術(shù)檢測結(jié)果 通過ELASA法檢測，有90例患者呈現(xiàn)陽性，60例呈現(xiàn)陰性；通過PCR技術(shù)檢測，有110例患者呈現(xiàn)陽性，40例呈現(xiàn)陰性。見表2。

表2 ELASA法及PCR技術(shù)檢測結(jié)果（n）

2.3 兩種檢查方式結(jié)果比較 PCR技術(shù)敏感度比較明顯高于ELASA法，ELASA法特異度明顯高于PCR技術(shù)。見表3。

表3 兩種檢查方式結(jié)果比較（%）

3 討論

納米細(xì)菌屬于20世紀(jì)90年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌，非常微小，屬于生物學(xué)特性的一種革蘭陰性菌。該細(xì)菌呈球桿狀或，有部分呈球狀，整個直徑為50 500 mL，細(xì)菌壁較厚，無任何的莢膜與鞭毛。這種細(xì)菌可以直接通過0.10～0.40 nm的濾菌膜，在pH為7.40的生理性鈣磷濃度中可以直接形成一種羥石灰碳酸鹽結(jié)晶，這種羥石灰碳酸鹽結(jié)晶能夠受此作用的影響而產(chǎn)生非常堅硬的礦化外殼，并且直接在菌體周圍所覆蓋，這樣會使很多高溫強(qiáng)酸的微生物依然可以在這種極為艱難的環(huán)境下正常生存，正常進(jìn)行繁殖[6-8]。納米細(xì)菌的生長非常緩慢，倍增的時間一般在1～3 d，無任何典型的形態(tài)學(xué)特征[9-10]。納米細(xì)菌在非常多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中都起著至關(guān)重要的作用[11]。納米細(xì)菌在關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病，甚至在人體組織內(nèi)病理性鈣化和硬化疾病也具有一定的作用[12-14]。納米細(xì)菌在生理性鈣磷濃度中就能在其周圍形成一種礦化外殼，這種外殼會在一定程度上引起結(jié)石、鈣化或在組織器官內(nèi)同時可產(chǎn)生脂多糖成分，這種成分參與了整個炎癥過程，為各種疾病的發(fā)生和發(fā)展提供更多的機(jī)會[15]。肝病是我國臨床上最常見的一種疾病，主要有急性肝炎、慢性肝炎以及肝硬化等，這些病癥都直接影響患者的身體健康以及生活質(zhì)量。肝病的發(fā)展與納米細(xì)菌相關(guān)[16-17]。

此次研究發(fā)現(xiàn)，肝病患者納米細(xì)菌的總感染率顯著高于健康人；通過ELASA法檢測，有90例患者呈現(xiàn)陽性，60例呈現(xiàn)陰性；通過PCR技術(shù)檢測，有110例患者呈現(xiàn)陽性，40例呈現(xiàn)陰性，兩種方法的陽性檢出率無明顯差異。由此可見，聚合酶鏈反應(yīng)法是一種可靠、安全的方法，應(yīng)用在納米細(xì)菌的檢測中具有顯著的效果。納米細(xì)菌感染機(jī)體組織和細(xì)胞，有效分泌鈣化脂多糖生物膜，在感染的過程中還會出現(xiàn)一定的炎性因子，會威脅到患者的生命安全[18]。慢性乙型肝炎、肝硬化肝癌的發(fā)生機(jī)制在當(dāng)前臨床研究中尚未明確。此次研究充分證實了慢性肝病、肝癌患者血清、組織中都存在納米細(xì)菌感染，且感染率高于健康人。如果可以有效確立納米細(xì)菌的病因?qū)W理論，就可以為相關(guān)并的預(yù)防提供有效、新型的檢測方法[19-21]。

綜上所述，對于肝病患者，采用聚合酶鏈反應(yīng)法開展檢測工作其效果非常顯著，可以證明部分慢性肝病、組織中存有納米細(xì)菌感染，證明肝病患者納米細(xì)菌的總感染率顯著高于健康人，納米細(xì)菌感染與肝病發(fā)展的過程中有著一定的聯(lián)系。