川明參多糖在體外模擬消化過程中的結(jié)構(gòu)變化及對(duì)消化酶活性的影響

高濤,羅黃洋,吳韌,閻睿,2,賀靈芝,2,程飛,唐華麗*

1(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,重慶,404100) 2(重慶市萬州藥品檢驗(yàn)所,重慶,404100)

川明參(ChuanminshenviolaceumSheh et Shan)作為一種具有藥食兩用潛力的傳統(tǒng)中藥,是傘形科多年生草本植物,主要分布于四川與湖北等地,富含多糖[1]、香豆素[2]、氨基酸[3]及脂肪酸等物質(zhì)[4]。多糖作為川明參中活性物質(zhì)的主要成分,具有較好的增強(qiáng)免疫[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]和抗氧化[8-9]等生物活性。川明參作為一種潛在的食品資源,目前對(duì)其他營養(yǎng)素的消化吸收的影響還未見報(bào)道。α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶是消化道中主要的消化酶,主要負(fù)責(zé)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等常見營養(yǎng)素的消化[10]。值得注意的是,消化酶不僅影響食物的消化吸收,還與一些疾病有關(guān),例如糖尿病[11]、肥胖[12]、心血管疾病[13]、高血壓[14]、胃食管反流病[15]、扁桃體肥大等[16]。

絕大多數(shù)植物多糖不能完全被消化道降解,進(jìn)而到達(dá)結(jié)腸,被腸道微生物發(fā)酵利用[17]。但也有數(shù)據(jù)表明,人體消化液對(duì)于多糖的結(jié)構(gòu)依舊存在一定的影響[18]。川明參多糖作為一種葡聚糖,且含有較多的(1→4)-α-D-Glcp,故探究川明參多糖在消化過程中的結(jié)構(gòu)變化顯得尤為重要。消化實(shí)驗(yàn)最好的方式是直接在生物體內(nèi)部進(jìn)行,但由于消化系統(tǒng)的復(fù)雜性、道德約束及實(shí)驗(yàn)成本等方面的原因,大多數(shù)情況都是選擇體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)消化的方式進(jìn)行的[19]。

本文采用超聲輔助水提醇沉法提取川明參粗多糖(Chuanminshenviolaceumpolysaccharides,CVPs),經(jīng)纖維素柱和凝膠柱層析制備川明參多糖主要成分(CVPs-1-G)。采用體外模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)合凝膠滲透色譜和質(zhì)譜探究川明參多糖在模擬消化過程中的結(jié)構(gòu)變化以及寡糖生成情況,并測(cè)定各階段消化產(chǎn)物對(duì)消化酶活性的影響。此外,以結(jié)合自由能為指標(biāo),采用分子對(duì)接技術(shù)研究CVPs-1-G消化后生成的寡糖對(duì)消化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川明參購自于重慶市萬州區(qū)中草藥市場(chǎng),粉碎后過40目篩,于95%的乙醇中浸泡1 d后除去小分子物質(zhì),過濾收集沉淀,保存于45 ℃烘箱中；α-淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、可溶性淀粉、三氯乙酸、4-硝基苯棕櫚酸酯,上海麥克林試劑有限責(zé)任公司；DNS試劑、PBS、Tris-HCl,飛凈生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器及設(shè)備

UV-2450紫外可見光分光光度計(jì),LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司；Imark酶標(biāo)儀,BIO-RAD公司；ALPH1-2/LD-Plus冷凍干燥機(jī),德國CHRIST公司；LC-10A型高效液相色譜儀；TSQ Quantum質(zhì)譜儀,美國賽默飛公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 川明參粗多糖的提取

按文獻(xiàn)[8]的方法制備川明參粗多糖。稱取一定質(zhì)量川明參粉置于2 000 mL錐形瓶中,按料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水溶解。在300 Hz,60 ℃條件下,超聲提取90 min。過濾濃縮后,按4∶1的體積比向濃縮液中加入Sevag試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1],劇烈振蕩20 min,收集水相,重復(fù)6次后,加入無水乙醇沉淀至乙醇體積分?jǐn)?shù)至80%。靜置過夜,離心收集沉淀,真空冷凍干燥即可得到粗多糖粉末。

1.3.2 CVPs-1-G的制備

稱取500 mg川明參粗多糖粉末溶于10 mL去離子水中,8 000 r/min離心10 min,取上清液過0.45 μL水系濾膜后上樣。分別用0、0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。色譜柱為DEAE-52纖維素柱(2.5 cm×60 cm),設(shè)置流速為1 mL/min,每10 min收集一管。收集NaCl濃度為0 mol/L的洗脫組分,按上述步驟操作進(jìn)行Sephadex G-100凝膠柱(2.5 cm×60 cm)層析,洗脫曲線為單峰,收集峰并冷凍干燥即為CVPs-1-G。

1.3.3 CVPs-1-G的體外模擬消化

1.3.3.1 模擬口腔消化

模擬口腔消化實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[17]和[20]的方法進(jìn)行。收集6名符合條件的志愿者的新鮮唾液,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,按照RUTH等[21]的方法測(cè)定唾液淀粉酶活性,并于-20 ℃條件下保存待用。取5 mL唾液放置于37 ℃條件下預(yù)熱30 min,加入5 mL多糖溶液(10 mg/mL)于37 ℃條件下保持0、5、15、30 min后沸水浴10 min。測(cè)定分子質(zhì)量與還原糖生成量。

1.3.3.2 模擬胃消化

參考文獻(xiàn)[17]的方法配制模擬胃液，并參考文獻(xiàn)[17]和[20]的方法進(jìn)行模擬胃消化。首先將經(jīng)唾液消化30 min的多糖溶液用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,再進(jìn)行模擬胃消化實(shí)驗(yàn)。取5 mL胃液和5 mL調(diào)節(jié)好pH的唾液消化產(chǎn)物,放置于恒溫振蕩器中進(jìn)行反應(yīng),調(diào)節(jié)溫度為37 ℃,振蕩速度為120 r/min。反應(yīng)1、2、4、6 h后取出沸水浴10 min,消化產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析,再經(jīng)Sevag法除蛋白質(zhì)后冷凍干燥,測(cè)定分子質(zhì)量及還原糖生成量。

1.3.3.3 模擬小腸消化

參考文獻(xiàn)[17]的方法配制模擬小腸液體,并參考文獻(xiàn)[17]和[20]的方法進(jìn)行模擬小腸消化。首先將經(jīng)模擬胃消化6 h后的多糖消化液用1 mol/L的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0,再進(jìn)行模擬小腸消化實(shí)驗(yàn)。取10 mL調(diào)好pH的多糖胃消化液和3 mL小腸液混勻,放置于恒溫振蕩器中,調(diào)節(jié)溫度為37 ℃,振蕩速度為120 r/min。反應(yīng)1、2、4、6 h后取出沸水浴10 min,消化產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析,再經(jīng)Sevag法除蛋白質(zhì)后冷凍干燥,并測(cè)定分子質(zhì)量及還原糖生成量。

1.3.4 分子質(zhì)量、還原糖生成量及寡糖含量測(cè)定

1.3.4.1 分子質(zhì)量測(cè)定

精密稱取5 mg樣品溶于1 mL超純水配制的0.05 mol/L的NaCl溶液中，超聲波溶解后于12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜后上機(jī)分析。上樣量20 μL；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃。流動(dòng)相為0.05 mol/L的NaCl溶液。

1.3.4.2 還原糖生成量測(cè)定

精確稱取干燥后的多糖消化產(chǎn)物,以葡萄糖為對(duì)照,采用DNS法測(cè)定還原糖含量。

1.3.4.3 寡糖測(cè)定

稱取5 mg經(jīng)唾液消化、胃消化和小腸消化的干燥樣品溶于10 mL去離子水,12 000 r/min離心10 min,取上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后過0.22 μm水系濾膜后進(jìn)行上機(jī)分析。氣體流速為12 L/min,噴霧電壓為3.0 kV,離子源溫度為320 ℃,上樣速度為20 μL/min,掃描范圍為150～3 000 Da,數(shù)據(jù)記錄時(shí)間為10 min。

1.3.5 消化產(chǎn)物對(duì)消化酶活性的影響

1.3.5.1 α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定α-淀粉酶抑制活性[22]。取1 mL的α-淀粉酶溶液(1 mg/mL,采用pH 7.2的0.1 mol/L的PBS配制)于37 ℃條件下預(yù)熱10 min，隨后加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的可溶性淀粉溶液,于37 ℃條件下反應(yīng)10 min。反應(yīng)完成后,加入1 mL的DNS試劑于100 ℃條件下放置5 min。冷卻至室溫,加入5 mL蒸餾水,于540 nm處測(cè)定紫外吸收波長(zhǎng)。以阿卡波糖為對(duì)照,α-淀粉酶抑制率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A1,樣品組的吸光度值;A2,蒸餾水代替可溶性淀粉的吸光度值;A3,蒸餾水代替樣品和酶的吸光度值;A4,蒸餾水代替樣品的吸光度值。

1.3.5.2 脂肪酶抑制活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定脂肪酶抑制活性。于96孔酶標(biāo)板中加入50 μL不同濃度的樣品溶液與50 μL的胰脂肪酶溶液(5 mg/mL，采用pH 7.0的0.2 mol/L的Tris-HCl配制)，并于37 ℃條件下預(yù)熱10 min。隨后，加入200 μL濃度為2 mmol/L的4-硝基苯棕櫚酸酯(先溶于異丙醇，再以Tris-HCl進(jìn)行稀釋)在37 ℃條件下反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成后于405 nm處測(cè)定紫外吸收波長(zhǎng)。以奧利司他為對(duì)照，胰脂肪酶抑制活性按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A1,樣品組的吸光度值;A2,蒸餾水代替酶的吸光度值;A3,蒸餾水代替樣品的吸光度值;A4,蒸餾水代替樣品和酶的吸光度值。

1.3.5.3 胃蛋白酶抑制活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]的方法測(cè)定川明參多糖的胃蛋白酶活性。取1 mL胃蛋白酶溶液(1 mg/mL，用pH 2的PBS進(jìn)行配制)和1 mL不同濃度的樣品溶液于37 ℃條件下預(yù)熱20 min。隨后，加入2 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的BSA溶液于37 ℃條件下反應(yīng)10 min。最后，加入2 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，于275 nm處測(cè)定紫外吸光度值。以抑肽素為對(duì)照，胃蛋白酶抑制活性按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：A1,樣品組未反應(yīng)的吸光度值;A2,樣品組反應(yīng)后的吸光度值;A3,對(duì)照組(蒸餾水代替樣品)未反應(yīng)的吸光度值;A4,對(duì)照組(蒸餾水代替樣品)反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.6 分子對(duì)接

采用Chem3D繪制CVPs-1-G消化產(chǎn)物中主要生成寡糖(二糖)的結(jié)構(gòu)式,保存為mol2格式,再將其導(dǎo)入Autodock軟件保存為pdbqt格式。在PDB數(shù)據(jù)庫下載α-淀粉酶(https://www.rcsb.org/structure/3DHP)、脂肪酶(https://www.rcsb.org/structure/1LPB)和胃蛋白酶(https://www.rcsb.org/structure/3UTL)的PDB文件,將其導(dǎo)入Pymol軟件去除配體,去水加氫并保存為PDB格式文件,再將其導(dǎo)入Autodock軟件保存為pdbqt格式文件。最后采用Autodock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算其分子結(jié)合自由能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),方差齊性時(shí),組間對(duì)比LSD檢驗(yàn),方差不齊性時(shí),采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。根據(jù)Probit回歸模型計(jì)算IC50。常規(guī)數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 2018進(jìn)行,分子對(duì)接繪圖采用Pymol進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 CVPs-1-G的制備及基本結(jié)構(gòu)

采用超聲波輔助水提醇沉法提取CVPs,并經(jīng)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱分離純化以制備CVPs-1-G。CVPs-1-G是一種分子質(zhì)量為(8.1±0.5) kDa,Mw/Mn為1.19,主要由(1→4)-α-D-Glcp組成,并含有一定量的(1→6)-α-D-Glcp,支鏈通過→4)-α-D-Glcp-(1→與(1→3,6)-α-D-Glcp的O-3和O-6位相連的葡聚糖[25]。其精細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 CVPs-1-G的精細(xì)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of CVPs-1-G

2.2 CVPs-1-G在模擬消化過程中的結(jié)構(gòu)變化及寡糖生成情況

2.2.1 CVPs-1-G在唾液消化過程中的分子質(zhì)量及還原糖生成量的變化

唾液作為與第一個(gè)與食物接觸的消化液,其中最重要的水解酶為淀粉酶,可水解碳水化合物中的α-1,4糖苷鍵[21,26]。前期的研究表明,CVPs-1-G是一種葡聚糖,并含有一定量的(1→4)-α-D-Glcp。所以,探究CVPs-1-G在唾液中的消化情況極有必要。經(jīng)測(cè)定后發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)選用的唾液其唾液淀粉酶活性為(176±15) U/mL,此結(jié)果在RUTH等[21]報(bào)道的18～204 U/mL范圍內(nèi),符合實(shí)驗(yàn)要求。

CVPs-1-G在唾液消化過程中分子質(zhì)量及還原糖含量的變化如表1和圖2所示。CVPs-1-G隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)其在高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)圖上的保留時(shí)間也隨之延長(zhǎng),該結(jié)果表明CVPs-1-G隨著唾液消化時(shí)間的延長(zhǎng)分子質(zhì)量也隨之降低。經(jīng)唾液消化30 min后,CVPs-1-G的分子質(zhì)量從原來的7.86 kDa降低到5.16 kDa。此外,隨著唾液消化時(shí)間的延長(zhǎng),其還原糖含量也顯著增高,從最開始的0.005 mg/mL上升到0.216 mg/mL。綜上,CVPs-1-G在模擬唾液消化的過程中,結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。

表1 不同消化時(shí)間下CVPs-1-G的分子質(zhì)量及還原糖含量Table 1 Molecular weight and reducing sugar content of CVPs-1-G under different digestion conditions

a-分子質(zhì)量;b-還原糖生成量圖2 CVPs-1-G在模擬唾液消化過程中分子質(zhì)量及還原糖生成量Fig.2 Molecular weight of CVPs-1-G and the content of reducing sugar during simulated salivary digestion

2.2.2 CVPs-1-G在胃消化過程中的分子質(zhì)量及還原糖生成量的變化

食物經(jīng)唾液初步消化后被送入胃中,在胃酸的作用及胃的蠕動(dòng)下被消化,而唾液淀粉酶在胃酸的作用下失活[27]。CVPs-1-G經(jīng)唾液模擬消化30 min后進(jìn)行胃液模擬消化,其分子質(zhì)量及還原糖含量變化如表1和圖3所示。隨著模擬胃消化時(shí)間的延長(zhǎng),CVPs-1-G在HPGPC中的保留時(shí)間無明顯變化,表1中的分子質(zhì)量變化也無明顯差異。此外,通過DNS法測(cè)得的各消化時(shí)間段的還原糖含量也無顯著性差異。綜上,CVPs-1-G在模擬胃消化階段不會(huì)發(fā)生任何變化。

a-分子質(zhì)量;b-還原糖生成量圖3 CVPs-1-G在模擬胃消化過程中分子質(zhì)量及還原糖生成量Fig.3 Molecular weight of CVPs-1-G and the content of reducing sugar during simulated gastric digestion

2.2.3 CVPs-1-G在小腸消化過程中的分子質(zhì)量及還原糖生成量的變化

小腸是碳水化合物消化吸收的重要場(chǎng)所,探究CVPs-1-G在小腸中的變化顯得很有必要。CVPs-1-G經(jīng)唾液模擬消化30 min、胃消化6 h后進(jìn)行小腸模擬消化如表1和圖4所示，與小腸消化60 min的HPGPC圖相比,小腸消化120 min的HPGPC圖中CVPs-1-G的保留時(shí)間被延長(zhǎng)。但隨著小腸消化時(shí)間的延長(zhǎng),CVPs-1-G在HPGPC圖上的保留時(shí)間無明顯變化。與胃液消化360 min時(shí)CVPs-1-G的分子質(zhì)量(5.06 kDa)相比,CVPs-1-G在小腸消化120 min以內(nèi)的分子質(zhì)量均顯現(xiàn)出下降的趨勢(shì),于小腸消化120 min后達(dá)到穩(wěn)定。其小腸消化360 min后的分子質(zhì)量為3.93 kDa。此外,在小腸消化產(chǎn)物的還原糖含量上也表現(xiàn)出了相似的變化,小腸消化120 min后的消化產(chǎn)物的還原糖含量顯著高于消化60 min后的消化產(chǎn)物。小腸消化120 min后,隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng),其還原糖含量未發(fā)生明顯改變。其結(jié)果表明,CVPs-1-G在經(jīng)唾液消化和胃消化后在小腸消化階段會(huì)被部分降解后保持穩(wěn)定。

a-分子質(zhì)量;b-還原糖生成量圖4 CVPs-1-G在模擬小腸消化過程中分子質(zhì)量及還原糖生成量Fig.4 Molecular weight of CVPs-1-G and the content of reducing sugar during simulated intestinal digestion

2.2.4 CVPs-1-G在模擬消化過程中的寡糖生成情況

采用電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS)測(cè)定經(jīng)唾液消化30 min、胃消化6 h和小腸消化6 h后的消化產(chǎn)物中的寡糖。消化產(chǎn)物經(jīng)透析膜(100 Da)透析除去小分子物質(zhì),再經(jīng)Sevag法除蛋白質(zhì)后進(jìn)行ESI-MS分析。CVPs-1-G模擬消化產(chǎn)物的ESI-MS如圖5所示,由于在消化的過程中使用大量的NaCl,使得產(chǎn)生的寡糖基本以[M+2 Na]+的形式存在。如圖5所示,CVPs-1-G經(jīng)模擬消化后主要產(chǎn)生了單糖、二糖、三糖、四糖及五糖,其中二糖含量最高,其次是四糖,五糖含量最低。由于模擬消化過程中的碳水化合物水解酶均只能水解α-1,4-糖苷鍵,并結(jié)合圖1的CVPs-1-G的結(jié)構(gòu)信息,推測(cè)模擬消化后產(chǎn)生的二糖為Glcp-α-1,4-Glcp(水解不完全形成的麥芽糖)和Glcp-α-1,6-Glcp。

圖5 CVPs-1-G經(jīng)模擬消化后的ESI-MS圖Fig.5 ESI-MS of CVPs-1-G after simulated digestion in vitro

2.3 CVPs-1-G在模擬消化產(chǎn)物對(duì)消化酶活性的影響

α-淀粉酶及脂肪酶主要在小腸消化階段發(fā)揮作用,胃蛋白酶主要在胃消化階段發(fā)生作用,故僅需考察CVPs-1-G的小腸消化產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶和脂肪酶活性的影響,胃消化產(chǎn)物對(duì)胃蛋白酶抑制活性的影響。如圖6所示,與CVPs-1-G相比,CVPs-1-G消化產(chǎn)物的α-淀粉酶、脂肪酶及胃蛋白酶抑制活性的IC50值均有顯著降低(P<0.05),其結(jié)果表明CVPs-1-G經(jīng)模擬消化后其α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶抑制活性均有一定程度的增強(qiáng)。

采用皮爾遜相關(guān)性分析考察CVPs-1-G消化產(chǎn)物與消化酶抑制活性之間的關(guān)系,結(jié)果如表2所示。CVPs-1-G消化產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性和胃蛋白酶抑制活性與其分子質(zhì)量大小顯著負(fù)相關(guān),與其還原糖生成量顯著正相關(guān)。其結(jié)果表明,CVPS-1-G的消化產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的抑制活性隨著其分子質(zhì)量的降低和還原糖含量的升高而升高。

2.4 分子對(duì)接結(jié)果分析

根據(jù)寡糖分析的結(jié)果,采用分子對(duì)接考察CVPs-1-G消化產(chǎn)物中的寡糖對(duì)消化酶活性的影響。各二糖分子(Glcp-α-1,4-Glcp和Glcp-α-1,6-Glcp)與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的分子對(duì)接結(jié)合自由能結(jié)果如表3所示,各二糖分子與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的結(jié)合自由能均<-5 kJ/mol,表明各二糖分子與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶間具有較好的結(jié)合能力[28]。此外,在可能產(chǎn)生的這3種二糖分子中,Glcp-α-1,6-Glcp與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的結(jié)合能力最強(qiáng),表明該二糖分子可能具有更好的消化酶抑制活性。每個(gè)二糖分子與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的具體結(jié)合情況采用Pymol軟件進(jìn)行可視化分析,結(jié)果如圖7所示,每個(gè)二糖分子均能較好的通過氫鍵與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶結(jié)合在一起。

a-α-淀粉酶;b-脂肪酶;c-胃蛋白酶圖6 CVPs-1-G消化產(chǎn)物的α-淀粉酶、脂肪酶及胃蛋白酶抑制活性的IC50Fig.6 The IC50 of CVPs-1-G digestion products on α-amylase,lipase and pepsin inhibitory activities

表2 CVPs-1-G消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量及還原糖生成量與α-淀粉酶、脂肪酶及胃蛋白酶抑制活性的皮爾遜相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis of molecular weight and reducing sugar content of CVPs-1-G digestive products with α-amylase,lipase and pepsin inhibitory activities

表3 二糖組分與消化酶的分子對(duì)接結(jié)合自由能Table 3 Chemical shifts and coupling constant of residue A-G

圖7 二糖分子與消化酶的分子對(duì)接Fig.7 Molecular docking of disaccharides with digestive enzymes

3 結(jié)論

本文以川明參為原料,采用超聲輔助水提醇沉法提取CVPs,經(jīng)纖維素柱層析和凝膠柱層析分離純化得到CVPs-1-G。采用體外模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)合凝膠滲透色譜和質(zhì)譜探究CVPs-1-G在模擬消化過程中的結(jié)構(gòu)變化及寡糖生成情況,并測(cè)定各階段消化產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶抑制活性的影響。此外,采用分子對(duì)接技術(shù)探究CVPs-1-G消化后生成的寡糖對(duì)消化酶活性的影響。結(jié)果表明,CVPs-1-G在唾液消化階段與小腸液消化階段中存在一定降解,在胃消化階段較為穩(wěn)定,經(jīng)模擬消化后,主要產(chǎn)生的寡糖為二糖。此外,CVPs-1-G經(jīng)模擬消化后,其α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶抑制活性均有顯著增加,其α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶抑制活性與其分子質(zhì)量及還原糖生成量顯著相關(guān)。此外,分子對(duì)接結(jié)果顯示,CVPs-1-G經(jīng)模擬消化后生成的二糖分子與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的結(jié)合自由能均小于-5 kJ/mol,表明該二糖分子與α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶均具有較好的結(jié)合能力。