酒精中毒大鼠腦血管及細(xì)胞損傷相關(guān)超微結(jié)構(gòu)改變

趙 麗， 關(guān)繼奎， 陳嘉峰

隨著食入性酒精的大量攝入，酒精中毒(alcoholism)引發(fā)腦血管病變及腦組織損傷的病例在我國日漸增多。雖然目前國內(nèi)外對酒精中毒導(dǎo)致腦血管病變的機(jī)制已經(jīng)有了深入研究，但是對于腦血管及腦組織的超微結(jié)構(gòu)的損傷報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)制備了大鼠酒精中毒的動物模型，并通過透射電子顯微鏡觀察酒精中毒組大鼠與對照組大鼠腦血管及腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變，并對兩者之間的聯(lián)系進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar雄性大鼠38只，體重200～300 g，由長春高新醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。同一批大鼠隨機(jī)分為酒精中毒組22只與對照組16只，每籠5～6只，分籠飼養(yǎng)，按晝夜時(shí)程在室溫及穩(wěn)定濕度條件下以平衡飼料喂養(yǎng)，自然飲水。

1.1.2 主要試劑 食用酒精；無水乙醇(上海建原化工有限公司)；甲醛(山西開原化工廠)；蒸餾水；生理鹽水。

1.2 方法 酒精中毒大鼠動物模型制備：Wistar雄性大鼠正常喂養(yǎng)1 w后開始造模。酒精中毒組：每天每只大鼠按8 ml/kg以50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，其間間隔6 h，2 w后改為每天每只大鼠按10 ml/kg用50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，1 w后再改為每天每只大鼠 按12 ml/kg用50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，其間間隔均為6 h，共灌胃4 w。對照組：同時(shí)用等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。兩組大鼠均灌胃4 w后應(yīng)用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛及2%戊二醛按照1∶1體積配制的固定液經(jīng)升主動脈灌注固定后取出腦組織，切成1 mm3的組織塊置于3%的戊二醛中固定，逐級酒精脫水，Epon812定向包埋，超薄切片為700A厚度，經(jīng)檸檬酸鉛及醋酸鈾染色，切片通過透射電子顯微鏡觀察腦部超微結(jié)構(gòu)改變并探討腦功能損失相關(guān)機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)組最終可用于實(shí)驗(yàn)的大鼠15只，灌胃4 w后存活12只，死亡率為20%。2 w后對照組大鼠能夠適應(yīng)灌胃操作，體重正常增長。實(shí)驗(yàn)組大鼠始終存在灌胃困難。并逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)干枯、脫落、倦怠、進(jìn)食量減少、營養(yǎng)不良、消瘦等情況。灌胃2 w后約1/4的大鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)：偏側(cè)肢體癱瘓及病變側(cè)霍納氏征。3 w后兩組大鼠的體重(g)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，4 w后兩組大鼠體重差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 兩組大鼠存活及體重(g)比較

2.2 超微結(jié)構(gòu)改變 對照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為單層扁平上皮細(xì)胞，細(xì)胞表面有微絨毛突起。細(xì)胞核內(nèi)周邊處為染色較深的異染色質(zhì)，常染色質(zhì)(chromatin)位于細(xì)胞核的中央部分，染色較淺，分布均勻。核仁(nucleolus)明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富(見圖1)。造模組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣為單層扁平上皮細(xì)胞，但細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)增多，并可見丘狀突起。核仁不明顯。細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少(見圖2)。對照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，異染色質(zhì)染色較深，位于周邊，常染色質(zhì)染色較淺，分布均勻，位于中央。并可見多個(gè)核孔。核仁明顯，形狀規(guī)則(見圖3)。造模組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜斷裂，染色質(zhì)分布不均勻，見不到核孔，核仁不明顯，形狀不規(guī)則(見圖4)。對照組大鼠海馬(hippocampus)內(nèi)的髓鞘結(jié)構(gòu)(brain myelination)為由多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣結(jié)構(gòu)。其切面呈同心圓狀(見圖5)。造模組大鼠海馬內(nèi)可見輕度脫髓鞘改變，多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘有輕度脫落及破壞(見圖6)。對照組大鼠額葉內(nèi)線粒體(mitochondrion)為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍而成，由內(nèi)膜折疊形成的嵴為彎曲的管狀，嵴平行排列，數(shù)目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(ribosome)(見圖7)。造模組大鼠額葉內(nèi)的線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現(xiàn)斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落(見圖8)。對照組大鼠額葉內(nèi)可見大量的管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough surfaced endoplasmic reticulum，RER)，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個(gè)散在或者以多聚核糖體的形式存在(見圖9)。造模組大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失(見圖10)。

圖1 對照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有微絨毛突起。細(xì)胞核周邊為異染色質(zhì)，常染色質(zhì)位于中央，分布均勻。核仁明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富(×12000)。圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)增多，可見丘狀突起。核仁不明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少(×12000)。圖3 對照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，并可見多個(gè)核孔。核仁明顯，形狀規(guī)則(×20000)。圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜斷裂，染色質(zhì)分布不均勻，見不到核孔，核仁不明顯，形狀不規(guī)則(×20000)。圖5 對照組大鼠海馬內(nèi)髓鞘為多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣結(jié)構(gòu)。其切面呈同心圓狀(×40000)

圖6 實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬內(nèi)可見輕度脫髓鞘改變，多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘有輕度的脫落及破壞(×40000)。圖7 對照組大鼠額葉內(nèi)線粒體為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍，內(nèi)膜折疊形成嵴，平行排列，數(shù)目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(×80000)。圖8 實(shí)驗(yàn)組大鼠額葉內(nèi)線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落(×80000)。圖9 對照組大鼠額葉內(nèi)可見大量管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個(gè)散在或者以多聚核糖體的形式存在(×50000)。圖10 實(shí)驗(yàn)組大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失(×50000)

3 討 論

慢性酒精中毒可引起體內(nèi)生物酶活性改變，導(dǎo)致基本新陳代謝異常，同時(shí)還引起大量細(xì)胞毒性反應(yīng)[1]。研究表明酒精中毒會引起胚胎發(fā)育期的浦肯野細(xì)胞和其他神經(jīng)細(xì)胞變性，引起神經(jīng)軸索變性，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。大腦海馬體主要負(fù)責(zé)長、短時(shí)間記憶、存儲轉(zhuǎn)換和定向等功能，是幫助人類處理長期學(xué)習(xí)與記憶聲光、味覺等事件的主要區(qū)域。從1950年起，科學(xué)家就已經(jīng)注意到大腦海馬區(qū)與記憶間的關(guān)系，海馬體在大腦中幫助人體記憶分析，記憶篩選，是人體的記憶系統(tǒng)，發(fā)揮所謂的“敘述性記憶”功能。海馬神經(jīng)元的退變是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退的直接原因[3]。我們在酒精中毒大鼠的海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)由多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘破壞了應(yīng)有的同心圓結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)輕度脫落及破壞，是造成早期大腦認(rèn)知功能障礙的原因之一；Porter、Claude和Fullam等人于1945年發(fā)現(xiàn)，他們在觀察培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，建議叫做內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)。分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩類。細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達(dá)程度與其生命活動的旺盛程度呈正相關(guān)，凡蛋白質(zhì)合成旺盛的細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會更發(fā)達(dá)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量的高低也常反映腫瘤細(xì)胞的分化程度。在神經(jīng)細(xì)胞中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與記憶有關(guān)。慢性酒精中毒可以使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)存留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因表達(dá)激活，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress response,UPR)，從而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[4]。UPR通過降低蛋白質(zhì)合成在有限程度上減輕蛋白質(zhì)折疊給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)帶來的負(fù)荷，但是該調(diào)解有限，蛋白質(zhì)過度堆積和鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)一步失衡將導(dǎo)致細(xì)胞無法修復(fù)，乃至凋亡[5]；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著核糖體。Palade[6]于1955年在哺乳類與禽類動物細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，他將這種新細(xì)胞器描述為密集的微?；蝾w粒。核糖體是一種核糖核蛋白顆粒，主要由RNA(rRNA)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體脫落于胞漿內(nèi)，蛋白質(zhì)合成下降或消失。損傷恢復(fù)后其蛋白質(zhì)合成功能也隨之恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)能夠證實(shí)酒精中毒大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失，導(dǎo)致相關(guān)記憶性蛋白質(zhì)合成下降，也是造成認(rèn)知障礙的機(jī)制之一。但酒精中毒導(dǎo)致認(rèn)知障礙的產(chǎn)生部位及時(shí)間順序、干預(yù)措施需要進(jìn)一步探索；據(jù)Rizzuto等[7]研究，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間存在很密切的關(guān)聯(lián)，二者通過膜交換鈣離子、脂質(zhì)、糖化蛋白等物質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞會導(dǎo)致Ca2+攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而影響線粒體功能[8,9]。慢性酒精中毒造成機(jī)體游離自由基產(chǎn)生增多損傷神經(jīng)細(xì)胞功能，同時(shí)使線粒體中電子傳遞鏈活性抑制，使三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生減少及細(xì)胞損傷[10]。

本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確觀察到酒精中毒后大鼠大腦額葉皮質(zhì)細(xì)胞線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現(xiàn)斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落。此種改變可能與UPR及ATP減少有關(guān)；酒精中毒后小腦血管的改變是導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)及運(yùn)動障礙的基礎(chǔ)。小腦血管單層扁平上皮細(xì)胞的損傷直接導(dǎo)致小腦血液供應(yīng)障礙，我們認(rèn)為是后續(xù)運(yùn)動功能及共濟(jì)調(diào)節(jié)障礙的病理基礎(chǔ)之一。這種酒精中毒導(dǎo)致的小腦血管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷是否能完全修復(fù)、是否存在修復(fù)的閾值，需要我們后續(xù)研究進(jìn)一步探索。