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    基于標(biāo)記法的福白菊精油抗真菌機(jī)理研究

    2021-12-16 12:51:16吳美嬋王書珍邵秀麗
    關(guān)鍵詞:白菊羅丹明細(xì)胞膜

    付 俊,吳美嬋,王書珍,邵秀麗,何 峰,

    (1.黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黃岡438000;2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,黃岡438000;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南250355)

    真菌感染給人類健康帶來重大危害,科學(xué)家們一直致力于尋找安全、高效的抗真菌藥物[1~3].其中精油由于其廣譜抗真菌活性引起了研究人員的極大關(guān)注.例如,He等[4]發(fā)現(xiàn)來源于阿舒假囊酵母的精油具有廣譜抗真菌活性;Hu等[5]研究了紫蘇精油抗黃曲霉的作用機(jī)制;Diao等[6]通過測(cè)定茴香籽精油處理后酵母細(xì)胞內(nèi)容物的外泄研究了茴香籽精油對(duì)酵母細(xì)胞膜破壞作用;Tang等[7]發(fā)現(xiàn)用精油的主要組分香葉醇和檸檬醛處理黃曲霉后,黃曲霉細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的ROS,導(dǎo)致其細(xì)胞膜被破壞.這些研究啟發(fā)人們將來源豐富的精油作為天然的抗真菌候選藥物.

    菊花中含有多種生物活性物質(zhì),因此受到了研究人員的廣泛關(guān)注[8].Yang等[9]發(fā)現(xiàn)菊花中的木犀草素可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng);He等[10]發(fā)現(xiàn)菊花總黃酮可保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激作用;Wu等[11]從菊花中提取的多酚化合物顯示出有效的自由基清除活性;Han等[12]研究了5個(gè)菊花品種中的11常見種化合物,結(jié)果表明這些化合物具有潛在的抗炎作用;Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)菊花對(duì)SARS的治療和預(yù)防具有抗補(bǔ)體活性.但目前利用菊花精油進(jìn)行抗真菌研究的報(bào)道還較少,特別是專門利用標(biāo)記法研究精油抗真菌機(jī)理的報(bào)道更少.

    福白菊(Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju)是湖北省麻城市特產(chǎn)菊花品種,是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,2020年7月麻城福白菊入選中歐地理標(biāo)志首批保護(hù)清單.本文采用福白菊作為研究對(duì)象,通過有機(jī)溶劑萃取和水蒸氣蒸餾相結(jié)合制備了福白菊精油.分別采用健那綠、細(xì)胞膜熒光探針1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸鹽(DiI)、碘化丙啶(PI)、羅丹明123和溴化乙錠(EB)等染料標(biāo)記酵母細(xì)胞、酵母細(xì)胞膜、核酸線粒體膜以及質(zhì)粒DNA,研究了福白菊精油的抗真菌機(jī)理,以便為將植物精油開發(fā)成為天然抗真菌藥物提供理論依據(jù).

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    福白菊(Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju)采收于湖北省鳳凰山藥業(yè)有限公司福白菊種植基地,標(biāo)本保藏于黃岡師范學(xué)院標(biāo)本館(保藏編號(hào)為HGNU202000366);抗真菌實(shí)驗(yàn)所用的指示菌為釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiaeATCC 9080,S.cerevisiae),購(gòu)于上海魯微科技有限公司;染料健那綠(純度≥98%)、細(xì)胞膜紅色熒光探針DiI(純度≥98%)、碘化丙啶(純度98%)和溴化乙錠(純度≥95%)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;熒光染料羅丹明123(純度≥95%)購(gòu)于福州飛凈生物科技有限公司;其它化學(xué)試劑均為分析純,購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司.

    CX 41型熒光顯微鏡和CX41型高清顯微鏡,日本Olympus公司;A1 MP STORM型多光子-共聚焦顯微鏡,日本Nikon公司.

    1.2 福白菊精油的制備

    采集含苞待放的菊花花蕾進(jìn)行冷凍干燥,再用粉碎機(jī)將干燥后的花蕾粉碎.以正己烷為溶劑,將菊花花蕾與正己烷按質(zhì)量比1∶4進(jìn)行萃取,萃取時(shí)間3 h,期間適當(dāng)振蕩.抽濾得到萃取液,原料部分再利用正己烷進(jìn)行第二次和第三次萃取,合并所有萃取液進(jìn)行減壓蒸餾,濃縮后得到粗制毛油.利用水蒸汽對(duì)粗制毛油進(jìn)行蒸餾,得到油-水混合物.將油-水混合物在低溫條件下離心后,收集油層,然后用無水亞硫酸鈉進(jìn)行脫水,得到福白菊精油,置于棕色瓶中于4℃下避光保存.

    1.3 抗真菌機(jī)理研究

    釀酒酵母具有真核細(xì)胞生命活動(dòng)最基本的特征,常作為研究真核生物的模式生物.本文選用釀酒酵母為對(duì)象,使用健那綠、DiI、PI、羅丹明123和EB等染料來研究福白菊精油對(duì)釀酒酵母的抗真菌機(jī)理.

    將指示菌釀酒酵母接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中,于28℃培養(yǎng)10 h,離心收集培養(yǎng)的指示菌液,用磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液,pH=7.2)洗滌3次并制備成懸浮液,最終獲得細(xì)胞密度為106CFU/mL的酵母菌懸液.

    取3份1 mL酵母菌懸液于Eppendorf管中,分別加入0,10和20 μL福白菊精油,于30℃黑暗條件下孵育1 h.各管中均加入10 μL健那綠染料,于30℃黑暗條件下孵育過夜.培養(yǎng)后,洗去染料和精油,將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上,采用高清顯微鏡觀察樣品中釀酒酵母細(xì)胞的顏色變化來確定福白菊精油對(duì)酵母是否具有殺滅作用[14].

    利用DiI直接標(biāo)記酵母細(xì)胞膜,研究福白菊精油對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用.取3份1 mL酵母菌液于Eppendorf管中,分別加入10 μL DiI染料,于30℃黑暗條件下孵育過夜.分別加入0,10和20 μL福白菊精油,于30℃黑暗條件下孵育1 h.洗去染料和精油,將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上,利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察釀酒酵母溶液熒光強(qiáng)度變化,激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為549和565 nm[15].

    利用PI標(biāo)記酵母細(xì)胞膜被破壞后泄露的核酸,參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)一步研究福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用.利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時(shí)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535和615 nm[16].

    參照文獻(xiàn)[17]方法,利用羅丹明123標(biāo)記研究福白菊精油對(duì)酵母線粒體膜的作用,利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時(shí)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488和528 nm[17].

    向4個(gè)Eppendorf管中分別加入5 μL質(zhì)粒(PCAMBIA1303)和15 μL TE緩沖液[20 mmol/L Tris和2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA,pH=8.0)],然后向每個(gè)管中加入2 μL福白菊精油和1 μL EB溶液,混合均勻后于28℃下孵育3 h.將每個(gè)管中的樣品點(diǎn)樣在1.2%瓊脂糖凝膠上,電泳30 min(28℃,10 V),觀察各泳道中不同條帶的位置,以確定精油對(duì)質(zhì)粒DNA的破壞作用[18].以DNA marker、未處理的環(huán)形質(zhì)粒樣品和環(huán)形質(zhì)粒用內(nèi)切酶(Bam HI,0.1 mg/mL)處理后的樣品分別作為對(duì)照.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 精油的制備

    以福白菊為原料提取出的淡黃色福白菊精油具有濃郁的、獨(dú)特的菊花香味,產(chǎn)率為(0.64±0.2)%,高于神龍架產(chǎn)的野菊花精油(產(chǎn)率0.43%)[19],也高于西班牙產(chǎn)的菊花精油(產(chǎn)率0.1%)[20].

    2.2 抗真菌機(jī)理

    2.2.1 基于健那綠標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母的殺滅作用利用健那綠標(biāo)記時(shí)精油對(duì)酵母的殺滅作用如圖1所示.健那綠能夠標(biāo)記正常的酵母細(xì)胞[圖1(B)],隨著對(duì)酵母處理的精油量增加,健那綠標(biāo)記顏色變淺[圖1(C)],甚至完全消失[圖1(D)],與未標(biāo)記的酵母之間沒有明顯差異[圖1(A)].健那綠是專一性的活細(xì)胞線粒體染料,與線粒體中有活性的細(xì)胞色素C氧化酶(COX)結(jié)合后,可保持氧化狀態(tài),呈現(xiàn)藍(lán)綠色;而死亡細(xì)胞中COX失活,健那綠則被還原,呈現(xiàn)無色.在本文中,隨著處理酵母的精油量增加,健那綠標(biāo)記顏色變淺,甚至完全消失,說明精油對(duì)酵母的殺滅作用隨著濃度的增加而增強(qiáng),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14].

    Fig.1 Effect of Fubaiju essential oil on S.cerevisiae according to Jana green labeling

    2.2.2 基于DiI標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用利用DiI標(biāo)記時(shí)精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用如圖2所示,其中圖2(A)~(C)為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖2(D)~(F)為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖2(A)和(D),(B)和(E),(C)和(F)中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).DiI是一種親脂性的細(xì)胞膜探針,與細(xì)胞膜的親和力高,進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱.進(jìn)入細(xì)胞后DiI與完整細(xì)胞磷酯雙層膜結(jié)合后,可逐漸擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞膜,發(fā)出強(qiáng)烈的橙紅色熒光.當(dāng)細(xì)胞膜被破壞后,DiI從磷酯雙層膜上脫落,進(jìn)入水中,熒光變?nèi)?因此,DiI的熒光強(qiáng)弱可反映細(xì)胞膜破壞程度[21].從圖2可以看出,經(jīng)DiI標(biāo)記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細(xì)胞幾乎每個(gè)細(xì)胞都散發(fā)出熒光[圖2(D)],表明DiI能正常標(biāo)記細(xì)胞膜完整的酵母.利用10 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標(biāo)記的酵母細(xì)胞后,部分細(xì)胞的熒光消失[圖2(E)],表明當(dāng)酵母被精油處理后,一部分細(xì)胞膜被破壞,DiI從細(xì)胞膜上脫落,熒光減弱.利用20 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標(biāo)記的細(xì)胞后,幾乎所有細(xì)胞的熒光消失[圖2(F)],表明當(dāng)精油作用增強(qiáng)時(shí),細(xì)胞膜幾乎全部被破壞,DiI從細(xì)胞膜上完全脫落,酵母的熒光幾乎完全消失.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酵母的細(xì)胞膜是福白菊精油抗菌作用的靶點(diǎn)之一.

    Fig.2 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to DiI labeling

    2.2.3 基于PI標(biāo)記法的福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用利用PI標(biāo)記時(shí)精油對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜的破壞作用如圖3所示,其中圖3(A)~(C)為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖3(D)~(F)為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖3(A)和(D),(B)和(E),(C)和(F)中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).PI是一種紅色熒光染料,常用于核酸標(biāo)記.PI不能通過完整的細(xì)胞膜,但能穿過破損的細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合后發(fā)出熒光,可利用PI的熒光強(qiáng)弱判斷細(xì)胞膜被破壞后核酸泄露的程度[22].從圖3可以看出,未經(jīng)精油處理的酵母細(xì)胞無熒光[圖3(D)],說明細(xì)胞完整,PI未能穿過細(xì)胞膜與核酸結(jié)合.當(dāng)酵母被10 μL/mL精油處理后,發(fā)出少量熒光[圖3(E)],說明部分細(xì)胞的細(xì)胞膜被精油破壞,PI與細(xì)胞中泄露的核酸結(jié)合,發(fā)出熒光.當(dāng)精油濃度增加到20 μL/mL時(shí),幾乎每個(gè)細(xì)胞都發(fā)出熒光[圖3(F)],說明此時(shí)幾乎所有酵母的細(xì)胞膜都被破壞,PI與細(xì)胞中泄露的核酸結(jié)合,精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用隨著福白菊精油濃度增加而加強(qiáng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明酵母的細(xì)胞膜是福白菊精油抗真菌作用的靶點(diǎn)之一.

    Fig.3 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to PI labeling

    2.2.4基于羅丹明123標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母線粒體膜的破壞作用精油對(duì)釀酒酵母線粒體膜的破壞作用如圖4所示,其中圖4(A)~(C)為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖4(D)~(F)為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞,圖4(A)和(D),(B)和(E),(C)和(F)中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).羅丹明123是一種檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針,進(jìn)入正常細(xì)胞線粒體基質(zhì)后熒光強(qiáng)度降低或消失,但線粒體膜被破壞后,羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放,發(fā)出黃綠色熒光[18].從圖4可以看出,經(jīng)羅丹明123標(biāo)記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細(xì)胞無熒光,說明羅丹明123進(jìn)入細(xì)胞的線粒體基質(zhì)后熒光消失[圖4(D)].當(dāng)酵母被10 μL/mL精油處理后,發(fā)射出較弱的黃綠色熒光[圖4(E)],說明部分細(xì)胞的線粒體膜被破壞,羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放.當(dāng)精油濃度增加到20 μL/mL時(shí),發(fā)射出強(qiáng)的黃綠色熒光[圖4(F)],說明幾乎所有酵母的線粒體膜均被破壞,羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放出來.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酵母的線粒體是福白菊精油抗真菌作用的靶點(diǎn)之一.Guimar?es等[23]和Xu等[24]認(rèn)為精油中親脂性萜類和萜烯類化合物快速插入細(xì)胞膜、線粒體膜的膜系統(tǒng)后,由于其疏水性引起膜滲透性增加,破壞膜結(jié)構(gòu),使膜內(nèi)容物泄漏,導(dǎo)致菌體死亡.福白菊精油中含有大量的萜類和萜烯類化合物,這可能是其破壞真菌細(xì)胞膜、線粒體的原因.

    Fig.4 Effect of Fubaiju essential oil on mitochondrial membrane of S.cerevisiae according to rhodamine 123 labeling

    Fig.5 DNA destruction assay by Fubaiju essential oil according to EB labeling

    2.2.5 基于EB標(biāo)記法的福白菊精油對(duì)酵母DNA的破壞利用EB標(biāo)記時(shí),福白菊精油對(duì)酵母DNA的破壞作用如圖5所示.泳道1和泳道2分別表示DNA marker和環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303,泳道3是環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被Bam-HI內(nèi)切酶酶切后的線形質(zhì)粒,泳道4~7為環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被福白菊精油處理過的電泳結(jié)果,泳道4~7是平行樣.經(jīng)福白菊精油處理后,環(huán)形pCAMBIA1303形成大小不一的片段.有的片段在泳道中移動(dòng)得快,說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油破壞成線性片段;有的片段在泳道中移動(dòng)得慢,說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油改變了結(jié)構(gòu),使其在電泳作用下移動(dòng)得慢.這些結(jié)果表明,DNA可能是福白菊精油作用靶點(diǎn)之一.Chung等[16]發(fā)現(xiàn)韓茵陳(Artemisia iwayomogi)精油的主要成分Vulgarone B與PBR322質(zhì)粒結(jié)合后會(huì)改變其結(jié)構(gòu),使其比原PBR322質(zhì)粒更大,電泳作用下移動(dòng)得慢.福白菊精油中含有類似于Vulgarone B的物質(zhì)[25],但精油與DNA分子之間如何相互作用還有待于進(jìn)一步研究.

    3 結(jié) 論

    福白菊精油的抗真菌機(jī)理是通過多途徑、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的.它不僅能破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)含物外泄;還能夠穿過細(xì)胞膜后破壞線粒體膜,破壞DNA,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.不同于抗生素的抗菌作用位點(diǎn)單一而容易產(chǎn)生耐藥性,福白菊精油的多重作用機(jī)制可能使真菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性,這為植物精油作為天然抗真菌藥物的開發(fā)提供了新的思路.

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