快速測試片與國標方法測試脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌的對比

杜雅正，劉洪梅，安雪征, ，祁 娜

（1.中國食品添加劑和配料協會, 北京 100020；2.通標標準技術服務有限公司, 北京 100176）

乳清粉是干酪生產過程中的副產物，主要成分是乳糖和乳清蛋白[1-6]。脫鹽乳清粉顧名思義是將乳清粉進行脫鹽處理，是嬰兒配方乳粉的主要原料。在我國脫鹽乳清粉慢慢由進口開始轉變?yōu)橐M技術自主生產，通過控制脫鹽乳清粉的質量，保證下游嬰兒配方乳粉的安全，脫鹽乳清粉營養(yǎng)素含量變化上基本保持穩(wěn)定，蛋白質、脂肪、乳糖營養(yǎng)素含量很穩(wěn)定，給微生物的生長提供了充足的營養(yǎng)物質[7-10]。目前對脫鹽乳清粉每個生產環(huán)節(jié)進行風險評估和危害分析后，形成了危害分析及危害評估表，金黃色葡萄球菌污染是常見的危害之一。

自然界中葡萄球菌屬至少包括有20個種。金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬是一種病原菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37 ℃，最適生長pH7.4，其會引發(fā)人或動物許多嚴重性感染[11-17]。典型的金黃色葡萄球菌為球形，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性，是一種不利于人體的細菌。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，因此，生產加工過程中受其污染的機會很多，因金黃色葡萄球菌引起的感染僅次于大腸桿菌排在第二位，引發(fā)的中毒事件很多[18-20]。因此，在各個生產企業(yè)的加工過程中對金黃色葡萄球菌進行了嚴格的控制管理，快速、準確的獲得檢測結果顯得尤為重要。

對于金黃色葡萄球菌的檢測，目前有國標法、測試片法、試劑盒法、生物分子學方法和免疫學方法。國標法即以GB 4789.10-2016依據的檢測方法，通過Baird-Parker平板培養(yǎng)，其檢測步驟較為繁瑣，觀察相對耗時，較難滿足企業(yè)生產加工時食品安全的及時性檢測需要以及突發(fā)性食物中毒的檢測需要。免疫學方法操作簡單且成本低廉，但會受到食品本身基質及非金黃色葡萄球菌的影響，在檢測上有局限性。分子生物方法操作簡單且靈敏度高，但在引物設計上較為復雜。測試片法是近年來使用較廣的方法，通過與微生物代謝的顯色反應測定食品中微生物的含量，操作較簡便，價格較低廉，測試周期短，效率高[21-26]。本研究使用國標法和快速測試片法對脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌計數試驗結果進行對比研究，旨在探求較快速準確檢測脫鹽乳清粉金黃色葡萄球菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清粉（D90）A 恒天然集團；乳清粉（D90）B愛爾蘭Dairygolg公司；乳清粉（D70）C 愛沙尼亞Epiim公司，共18個批次的脫鹽乳清粉進行比對研究；直徑90 mm無菌培養(yǎng)皿、Baird-Parker瓊脂平板

北京陸橋技術服務有限公司；3MTMPetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片[27]（STX） 3M中國有限公司提供；金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株 上海林淵生物科技有限公司。為了保證數據結果符合國標的結果計算要求，一個稀釋度的平板典型菌落數控制在20～200 CFU/g之間，如果樣品的金黃色葡萄球菌菌數量小于150 CFU/g，則需添加標準菌株，制備人為污染樣品。

BMJ-250恒溫培養(yǎng)箱 28±1 ℃，上海博訊醫(yī)療生物有限公司；ME2002/E電子天平 感量為0.01 g，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；400cc均質器、SCAN100菌落計數器 法國英特賽恩斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的準備 采用金黃色葡萄球菌標準菌株，用接種環(huán)挑取一環(huán)凍存菌株于BHI肉湯中培養(yǎng)24 h，混勻，做梯度稀釋，為了方便讀取結果，在1:10和1:100兩個稀釋度都有一定數量的菌落生長，選擇金黃色葡萄球菌的數量控制在150～1500 CFU/g的菌懸液。

1.2.2 乳清粉樣液的制備 稱取25 g乳清粉至盛有225 mL生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1:10的樣品勻液。然后添加制備好的菌懸液1 mL到制備好的1:10乳清粉樣品勻液，充分混合。

1.2.3 乳清粉樣液的稀釋 用1 mL微量移液器吸取1:10乳清粉樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

1.2.4 接種與培養(yǎng)

1.2.4.1 測試片法 根據對樣品污染狀況的估計，按照國標方法中對于稀釋度的要求，選擇1:10和1:100兩個稀釋度的樣品勻液，將測試片置于平坦表面處，揭開上層膜，使用吸管將1 mL樣液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜蓋下。將壓板置于上層膜中央壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面上。拿起壓板，靜置至少1 min使培養(yǎng)基凝固。

將測試片的透明面朝上，可堆疊至多不超過20片，置于36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄24±2 h的結果。如果上述測試片上出現暗紫紅色（典型的金黃色葡萄球菌特征），無需進行確認；如果測試片上出現黑色、藍綠色菌落或紫紅色菌落不明顯，需使用確認反應片做進一步確認。將上層膜掀起，將確認反應片置入測試片的培養(yǎng)范圍內，再將上層膜放下覆蓋在確認反應片上，用手指以滑動的方式輕輕與確認反應片緊密接觸并除去氣泡，最后把插入確認反應片的測試片放在36±1 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1～3 h。如出現粉紅色環(huán)，判定為金黃色葡萄球菌。

1.2.4.2 國標法 根據對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker瓊脂平板，然后用無菌涂布棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25～50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失[27]。

在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36±1 ℃培養(yǎng)1 h；等樣品勻液吸收后翻轉平板，倒置后于36±1 ℃培養(yǎng) 24～48 h。

1.2.4.3 樣品本底試驗 本實驗考慮是否進行人工污染樣品，對全部18個樣品進行了測試，分別采用GB 4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第二法金黃色葡萄球菌平板計數法和快速測試片（3M快速測試片）檢測方法進行實驗和培養(yǎng)。

1.2.5 適應性試驗 人工污染樣品，選擇1:10和1:100兩個稀釋度，吸取 1 mL金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌懸液，加入1:10的樣品勻液內，渦旋混勻以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，用無菌涂布棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣，倒置平板于36±1 ℃培養(yǎng)48 h，觀察標準菌株的生長狀況和計數結果。

1.2.6 重復性試驗 參考ISO 4833-1：2013標準中準確度的要求[28]，對重復性進行考察，以短時間內同一人員使用相同場地、設備、方法測試兩次，兩次測試計數結果的對數值的絕對相差R≤0.25。

按照金黃色葡萄球菌測試片方法進行測試，觀察兩次測量結果。

1.2.7 對比試驗 分別向18個樣品勻液內加入1 mL金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株的菌懸液，渦旋混勻，制成待測樣液，每個待測樣液分別用GB 4789.10-2016和快速測試片的方法進行測試，獲得數據結果使用t檢驗進行差異性分析[29-30]。

1.3 數據處理

利用Excel 2016處理數據，用SPSS Statistics 22.0進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 樣品考察結果

篩選的具有代表性的18個樣品分別采用兩種方法測試，Baird-Parker平板和快速測試片在10-1稀釋度下均無菌落生長。由此可見，全部樣品需要使用標準菌株對其進行人工污染。結果見表1。

表1 脫鹽乳清粉樣品本底實驗結果Table 1 Background test results of desalted whey powder

Baird-Parker平板和快速測試片在10-1稀釋度下均無菌落生長，測試結果以＜10 CFU/g報出。

2.2 適應性試驗結果

通過對樣品勻液進行人工污染，樣品勻液中金黃色葡萄球菌的添加量范圍在15～150 CFU/g，經過36±1 ℃培養(yǎng)48 h后，結果如表2所示。金黃色葡萄球菌分別在Baird-Parker平板和快速測試片上體現的菌落生長情況，如表3所描述，此結果可以看出金黃色葡萄球菌ATCC 25923在脫鹽乳清粉樣品基質下生長未被抑制，生長情況正常。

表2 人工污染測試結果Table 2 Artificial pollution test results

表3 金黃色葡萄球菌形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of Staphylococcus aureus

2.3 快速測試片的重復性

在同一個實驗場地，兩次測試間隔1 h，使用相同的實驗設備和器材，同一名實驗員使用相同方法對每個樣品進行重復測試，測試依據參照ISO 4833-1：2013對準確度重復性的要求，重復性限r≤0.25，結果見表4。每個樣品測試結果均在可接受范圍內，由此可以得出結論兩次測試重復性良好。

表4 精密度測試結果Table 4 Precision test results

2.4 國標方法和快速測試片法進行對比試驗結果

結果如表5所示，18份脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌計數的檢測結果，使用Excel對數據結果進行t檢驗，對兩組獨立樣本從結果看出t=0.19，金黃色葡萄球菌測試項目t≤t（0.05/2,34），說明經t檢驗得知該測試項目的兩組結果沒有顯著性差異，兩種方法針對該樣品的檢測結果具有很好的一致性。

表5 兩種方法測試結果的比對Table 5 Comparison of test results of two methods

3 結論

本研究采用快速測試片法與國標方法針對脫鹽乳清粉樣品中金黃色葡萄球菌進行計數對比，本底實驗結果顯示樣品中金黃色葡萄球菌計數結果均＜10 CFU/g，需要人工污染樣品來進行方法研究，驗證標準菌株在兩種方法培養(yǎng)基上的生長狀況良好，菌落特征明顯。依據ISO 4833-1：2013對重復性的要求，考慮快速測試片方法的重復性結果，將第二次和第一次測試結果值進行比較，取其lg值均在重復性限r≤0.25的范圍之內，快速測試片的使用可滿足標準對重復性的要求。對兩種方法的對比數據進行差異性研究，使用t檢驗驗證無顯著性差異，對比結果有著良好的一致性。本實驗過程中發(fā)現，按照方法培養(yǎng)24 h，測試片上生長的菌落直徑較小，暗紫紅色現象不明顯，需要繼續(xù)再培養(yǎng)12 h以上，可明顯識別出來。國標方法需要進行革蘭氏染色和血漿凝固酶鑒定試驗，鑒定試驗操作培養(yǎng)時間在24 h以上，觀察相對耗時，測試片不需要進行單獨的鑒定。綜上所述，快速測試片法適用于食品配料脫鹽乳清粉的金黃色葡萄球菌計數的檢測，具有方法簡便，產品性能穩(wěn)定，檢測效率高的優(yōu)點。