貯藏方式對(duì)綠豆球蛋白結(jié)構(gòu)與溶解性的影響

苗志文，翟愛華,2, ，張東杰,2，曹龍奎,2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163000；2.國(guó)家雜糧技術(shù)工程研究中心，黑龍江大慶 163000）

綠豆中含有豐富的蛋白質(zhì)，其含量高達(dá)25%，且綠豆蛋白富含賴氨酸、亮氨酸和蘇氨酸3種必需氨基酸[1]。綠豆蛋白中的球蛋白含量高達(dá)80%，球蛋白不僅可以促進(jìn)膽酸膽鹽分解，有效降低血脂，還有刺激神經(jīng)興奮，增進(jìn)食欲的功效[2]。隨著人們對(duì)綠豆的營(yíng)養(yǎng)作用的重視，其消費(fèi)量大增，食用的綠豆一般真空包裝貯藏一段時(shí)間，在貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的品質(zhì)變化直接影響了其食用性。蛋白質(zhì)溶解性與結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，在貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)溶解性發(fā)生改變，盡而降低蛋白質(zhì)的乳化性、凝膠性和成膜性等加工特性[3]，同時(shí)降低蛋白的營(yíng)養(yǎng)特性。研究貯藏技術(shù)對(duì)綠豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響可指導(dǎo)綠豆的貯藏，提高綠豆的加工品質(zhì)。

已有研究表明貯藏方式對(duì)不同來(lái)源的植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、溶解性的變化有很大影響，王煒清等[4]發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，扁桃仁分離蛋白的溶解度和二級(jí)結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化；趙妍等[5]發(fā)現(xiàn)，貯藏時(shí)間相同時(shí)，低溫、低濕度下的小麥蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)減少最小，小麥品質(zhì)劣變速度變慢；Hou等[6]發(fā)現(xiàn)，較高的溫度、濕度條件下貯藏的大豆β-伴球蛋白的結(jié)構(gòu)與溶解度都較低溫有明顯變化；蔡曉寧等[7]發(fā)現(xiàn)，低水分（11.2%）、低溫（15 ℃）和氣調(diào)貯藏更有利于保持綠豆的品質(zhì)；趙卿宇等[8]發(fā)現(xiàn)貯藏后大米蛋白溶解度下降，但低溫會(huì)促進(jìn)鹽豐大米蛋白溶解。目前植物蛋白貯藏效果的研究主要針對(duì)不同溫度、濕度下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及溶解性的變化，研究的重點(diǎn)也是限于高溫條件下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，在自然溫度，不同氣調(diào)方式下長(zhǎng)期貯藏的綠豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化研究未見文獻(xiàn)，氣調(diào)與溫度相互作用下綠豆蛋白結(jié)構(gòu)與溶解性的變化方面的研究更少。因此，確定不同氣調(diào)方式及溫度對(duì)綠豆蛋白結(jié)構(gòu)與溶解性的影響研究對(duì)指導(dǎo)綠豆貯藏，保持其品質(zhì)具有非常重要的意義。

本研究以室溫氣調(diào)貯藏和4 ℃氣調(diào)貯藏18個(gè)月的綠豆為原料，通過(guò)與同組新收獲的綠豆特性進(jìn)行比較，分析不同貯藏方式下綠豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、巰基和二硫鍵、表面疏水性等結(jié)構(gòu)變化對(duì)溶解性的影響，確定最佳的氣調(diào)方式及貯藏溫度，為合理貯藏綠豆、利用綠豆中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆 取樣于黑龍江的綠豐二號(hào)品種（水分含量2.6%，蛋白質(zhì)含量26.5%）；NaCl 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；石油醚 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；NaOH 分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；HCl 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸） 分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；乙二胺四乙酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KBr 光譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LGJ-10C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CR22GⅡ/CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；UDK152自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司；RH-KT/C型磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；5810R高速冷凍離心機(jī)EPPENDORF公司；TENSORII傅里葉紅外光譜儀德國(guó)布魯克科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將新鮮的綠豆樣品分四組進(jìn)行包裝貯藏，貯藏條件為真空、N2+CO2（比例為1:1，下同）、N2、CO2，分別放在室內(nèi)避光干燥處與4 ℃冰箱內(nèi)，貯藏時(shí)間為18個(gè)月。同一批次的新鮮綠豆立即檢測(cè)作為對(duì)照。

1.2.2 球蛋白提取 采用Osborne分級(jí)提取法提取球蛋白[9]；將綠豆洗凈干燥后進(jìn)行磨粉、過(guò)篩，采用沸程30～60 ℃的石油醚脫脂得到脫脂綠豆粉。取100 g脫脂綠豆粉加入1 L去離子水，在室溫條件下攪拌浸提2 h，4 ℃條件下8000 r/min離心 20 min取沉淀，繼續(xù)加500 mL去離子水進(jìn)行二次水提，取沉淀用l000 mL 1 mol/L NaCl進(jìn)行浸提，在室溫條件下攪拌浸提2 h，4 ℃條件下8000 r/min離心20 min，收集上清液，將沉淀再加500 mL 1 mol/L NaCl進(jìn)行二次浸提，收集上清液。合并兩次上清液，4 ℃透析（MWCO:8000～12000 D）24 h，期間梯度換水，離心獲得沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，所得樣品即為球蛋白。

1.2.3 結(jié)構(gòu)性質(zhì)測(cè)定

1.2.3.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 將凍干樣品準(zhǔn)確稱量1.0 mg，與100 mg烘干的KBr混合充分研磨均勻后，使用壓片機(jī)壓制成透明薄片，隨后在干燥室溫的環(huán)境采集傅里葉紅外圖譜。采集條件為分辨率4 cm-1，掃描范圍400～4000 cm-1，樣品掃描次數(shù)為32次[10]。

1.2.3.2 紫外吸收光譜的測(cè)定 將提取的球蛋白用PH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配置成1.0 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，以相應(yīng)的緩沖溶液為參比，進(jìn)行紫外-可見光掃描，掃描范圍是 200～400 nm，掃描速度 2 nm/s；得到綠豆球蛋白的紫外吸收光譜[11]。

1.2.3.3 巰基、二硫鍵含量的測(cè)定 參照 Huang 等[12]的方法，用DNTB比色法測(cè)定巰基和二硫鍵的含量。即利用5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）與游離SH反應(yīng)，在波長(zhǎng)412nm處生成有最大吸收峰的黃色物質(zhì)后，采用分光光度法進(jìn)行吸光度測(cè)定而得到。

1.2.3.4 表面疏水性的測(cè)定 參照 Arzeni等[13]的方法，用ANS熒光探針測(cè)定球蛋白的表面疏水性（H0）。將樣品用pH7.0的1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解，8000 r/min離心20 min獲取上清液，測(cè)定上清液的濃度后將其梯度稀釋，分別得到濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，分別加入20 μL濃度為 8.0 mmol/L的 ANS試劑，混勻器混勻，避光放置20 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫寬度5 nm,以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，曲線的初始斜率即為該蛋白樣品的表面疏水性。

1.2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳的測(cè)定參照 Moritz 等[14]的方法，利用 SDS-PAGE 對(duì)蛋白質(zhì)分子量變化進(jìn)行分析。將凍干后的蛋白質(zhì)溶解于0.1 mol/L的NaOH溶液中，使其最終濃度為0.5 mg/mL，以1:4的比例加入樣品與樣品緩沖液（0.15 g Tris-HCl，0.02 g 溴酚藍(lán)，0.40 g SDS，2 mL 50%甘油，15 mLβ-疏基乙醇，混合并用蒸餾水中定容至10 mL）混勻，放入的離心管中，-20 ℃儲(chǔ)存，使用時(shí)用沸水煮制3～5 min使蛋白質(zhì)完全變性；上樣體積10 μL，濃縮膠與分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%，12%，電壓80 V恒壓，樣品下移至分離膠后電壓加至120 V，條帶接近膠板下邊緣時(shí)停止電泳，考馬斯亮藍(lán)G250染色后進(jìn)行脫色處理。

1.2.4 溶解性測(cè)定 參照 Lemos等[15]的方法，用Folin酚法測(cè)定球蛋白的溶解度。用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制5 mg/mL的蛋白溶液，攪拌30 min后8000 r/min離心10 min，分別將離心后的上清液1 mL堿性銅1 mL和福林酚試劑4 mL加入試管中立即混勻，55 ℃條件下反應(yīng)5 min，拿出后立即放入冷水靜置10 min，除去不溶性殘?jiān)?，于紫外分光光度?jì)650 nm處測(cè)吸光度。按式（2）計(jì)算溶解度：

式中；S代表溶解度，%；C1代表可溶性蛋白質(zhì)量，g；C0代表樣品中蛋白質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行了三次重復(fù)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以均值±SD表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Origin8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，利用Peakfit4.12軟件對(duì)譜圖中 1700～1600 cm-1酰胺Ⅰ區(qū)分峰處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏方式對(duì)球蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

2.1.1 貯藏方式對(duì)球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響變化 通過(guò)傅里葉紅外光譜對(duì)不同貯藏方式下的綠豆球蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，采用OMNIC8.0數(shù)據(jù)處理軟件，原譜進(jìn)行基線校正，參照去卷積參數(shù)，得到去卷積圖譜，不同貯藏方式的綠豆球蛋白傅里葉變換紅外光譜見圖1。

利用Origin8.0軟件對(duì)圖1中球蛋白紅外光譜中酰胺Ⅰ區(qū)（1700～1600 cm-1）進(jìn)行擬合，其中，1650～1660 cm-1區(qū)為α-螺旋，1610～1642 cm-1區(qū)為β-折疊，1642～1650 cm-1區(qū)為無(wú)規(guī)卷曲，1660～1680 cm-1區(qū)為β-轉(zhuǎn)角，1680～1700 cm-1區(qū)為β-反向[16]。不同貯藏條件的球蛋白樣品酰胺Ⅰ帶的擬合結(jié)果如圖2所示，擬合度R2=0.9999，據(jù)此計(jì)算得出的球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的各組分含量見表1。

圖1 不同貯藏方式下球蛋白傅里葉變換紅外光譜酰胺Ⅰ帶Fig.1 Globulin fourier transform infrared spectroscopy amide I band under different storage methods

圖2 不同貯藏方式下球蛋白酰胺Ⅰ帶的曲線擬合譜圖Fig.2 Curve fitting spectra of globulin amide I band under different storage methods

由表1可知，經(jīng)18個(gè)月的貯藏，不同貯藏方式下的綠豆球蛋白α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，分別最大增長(zhǎng)了4.73%與5.87%；無(wú)規(guī)則卷曲與β-折疊結(jié)構(gòu)均呈下降趨勢(shì)，分別最大下降了1.39%與13.21%。不同貯藏溫度下，室溫四種貯藏方式（真空、N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆與新鮮綠豆相比，球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量分別增加了4.73%、2.95%、2.77%、3.01%，差異顯著（P＜0.05），原因可能是貯藏中球蛋白發(fā)生氧化，使得球蛋白中無(wú)序的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)向有序的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)收縮，形成更多的螺旋結(jié)構(gòu)[17]，葉林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化會(huì)導(dǎo)致花生分離蛋白大分子聚集體的形成。氧化發(fā)生的條件是有適宜的溫度與充足的氧氣，氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05），可能是真空條件下，蛋白質(zhì)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)變小，但因結(jié)合室溫貯藏，仍會(huì)發(fā)生氧化[19]。而氣調(diào)貯藏下，有適宜的溫度，球蛋白氧化程度小于真空貯藏，說(shuō)明氣體延緩了球蛋白結(jié)構(gòu)的氧化，對(duì)其結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。4 ℃條件貯藏下的綠豆與新鮮綠豆相比，氣調(diào)貯藏（N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量差異不顯著（P＞0.05），且相比室溫貯藏，4 ℃貯藏后綠豆球蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)增量較小，說(shuō)明4 ℃條件會(huì)延緩球蛋白的氧化，減少結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明4 ℃與氣調(diào)條件都有保護(hù)球蛋白結(jié)構(gòu)，延緩氧化的作用。兩種貯藏溫度下，三種氣調(diào)貯藏之間差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明充氣包裝中的氣體種類并不影響氣體作用。

表1 不同貯藏方式的球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 1 Changes in the secondary structure of globulins in different storage methods

2.1.2 貯藏方式對(duì)球蛋白紫外吸收光譜的影響變化為了進(jìn)一步揭示貯藏方式對(duì)綠豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)其進(jìn)行紫外-可見光掃描，得到不同貯藏方式下球蛋白的紫外吸收光譜如圖3所示。

由圖3可知，在260～280 nm附近，不同貯藏條件的綠豆球蛋白均出現(xiàn)最大吸收峰，這是由于芳香族氨基酸的紫外吸收作用，其中起主要作用的酪氨酸的最大吸收波長(zhǎng)為Tyr 275 nm，色氨酸的最大吸收波長(zhǎng)為Trp 280 nm，和苯丙氨酸的最大吸收波長(zhǎng)為Phe 257 nm[18]。由圖可知，根據(jù)貯藏方式的不同，紫外掃描圖譜的變化趨勢(shì)是類似的，新鮮綠豆球蛋白在263～264 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，4 ℃氣調(diào)條件（N2+CO2、CO2、N2）貯藏下的綠豆球蛋白最大吸收峰也出現(xiàn)在264 nm附近，而除此之外，其他貯藏條件下的綠豆球蛋白出峰位置均發(fā)生改變，且最大吸收峰也出現(xiàn)不同程度的紅移。室溫N2以及室溫N2+CO2貯藏下的綠豆球蛋白出峰位置發(fā)生改變，峰強(qiáng)度也明顯增加。管斌等[20]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)紫外吸收光譜的變化可以推斷出蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。貯藏后的綠豆球蛋白最大吸收峰紅移，從溶劑效應(yīng)來(lái)分析，表明經(jīng)貯藏處理后，生色團(tuán)微環(huán)境由極性向非極性轉(zhuǎn)變，由此可知，不同方式貯藏后的綠豆球蛋白，結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集，芳香族氨基酸殘基被包埋，球蛋白的表面疏水性也降低[21]，同時(shí)，球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，發(fā)生聚集，這一結(jié)論也從前文中紅外光譜研究得到證實(shí)。

圖3 不同貯藏方式的球蛋白紫外吸收光譜的變化Fig.3 Changes of UV absorption spectra of globulins in different storage methods

2.1.3 貯藏方式對(duì)球蛋白巰基和二硫鍵的影響變化通過(guò)DTNB比色法對(duì)不同貯藏方式下綠豆球蛋白巰基和二硫鍵的變化進(jìn)行測(cè)定，不同貯藏方式對(duì)綠豆球蛋白巰基和二硫鍵的影響變化如圖4a～圖4b所示。由圖4a可知，不同貯藏溫度下，室溫四種方式（真空、N2+CO2、CO2、N2） 貯藏后的綠豆與新鮮綠豆相比，球蛋白巰基含量差異顯著（P＜0.05），可能是長(zhǎng)期室溫條件貯藏，酶活性相對(duì)較高，蛋白質(zhì)的新陳代謝加快，巰基被氧化，從而含量降低[22]，真空與氣調(diào)貯藏綠豆球蛋白巰基含量差異顯著（P＜0.05），真空條件會(huì)抑制酶的生理活動(dòng)進(jìn)行，延緩球蛋白的巰基氧化，而氣調(diào)貯藏下球蛋白巰基氧化程度低于真空條件，可能是氣體的存在降低綠豆球蛋白與空氣的接觸，起到了保護(hù)巰基不被氧化的作用[22]，這也與前文中α-螺旋結(jié)構(gòu)的變化相對(duì)應(yīng)。4 ℃條件貯藏下的綠豆與新鮮綠豆相比，氣調(diào)貯藏（N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆球蛋白巰基含量差異不顯著（P＞0.05），且相比室溫貯藏，4 ℃貯藏后的綠豆球蛋白巰基含量下降較小，原因是由于4 ℃貯藏不利于酶的生理活動(dòng)，從而對(duì)球蛋白的氧化也有延緩的作用；氣調(diào)與真空貯藏后的綠豆球蛋白巰基含量差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明貯藏過(guò)程中4 ℃和氣調(diào)貯藏都有延緩巰基氧化的作用。

由圖4b可知，不同貯藏溫度下，室溫四種貯藏方式（真空、N2+CO2、CO2、N2）的綠豆與新鮮綠豆相比，球蛋白二硫鍵含量差異顯著（P＜0.05），原因是長(zhǎng)期室溫條件加速巰基氧化，巰基發(fā)生脫氫反應(yīng)，大量的分子間二硫鍵生成，從而二硫鍵的含量上升；真空與氣調(diào)貯藏的綠豆球蛋白二硫鍵含量差異顯著（P＜0.05），原因是由于真空條件貯藏的巰基氧化程度大于氣調(diào)貯藏，二硫鍵的生成也差異顯著（P＜0.05）。4 ℃條件貯藏下的綠豆與新鮮綠豆相比，氣調(diào)貯藏（N2+CO2、CO2、N2）的綠豆球蛋白二硫鍵含量變化不顯著（P＞0.05），且相較室溫貯藏，4 ℃貯藏后的綠豆球蛋白二硫鍵含量上升較小，原因是4 ℃貯藏球蛋白的巰基氧化會(huì)受到抑制，導(dǎo)致二硫鍵的生成也受到影響；真空與氣調(diào)貯藏的綠豆球蛋白二硫鍵含量均差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明4 ℃和氣調(diào)貯藏都會(huì)延緩巰基的氧化，抑制二硫鍵的生成。張來(lái)林等[22]研究發(fā)現(xiàn)，稻谷巰基含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，溫度越高降低得幅度越大，而氣調(diào)貯藏下降幅度較小，本研究通過(guò)對(duì)球蛋白巰基與二硫鍵的變化研究得到，4 ℃和氣調(diào)貯藏會(huì)延緩巰基的氧化，減少二硫鍵的生成，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致。而貯藏過(guò)程中巰基的變化剛好與二硫鍵相反，證明在貯藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)巰基和二硫鍵呈現(xiàn)一定程度的轉(zhuǎn)化；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同條件貯藏下球蛋白的變性聚集機(jī)制與巰基、二硫鍵的變化密切相關(guān)，球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)被重新排列，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集[21]。

圖4 貯藏方式對(duì)球蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Fig.4 Effect of storage methods on the content of sulfhydryl and disulfide bonds of globulin

2.1.4 貯藏方式對(duì)球蛋白表面疏水性的影響變化蛋白質(zhì)分子的表面疏水性可以反映其表面疏水基團(tuán)的相對(duì)含量，是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要特性[23]，與蛋白質(zhì)的溶解性有很大關(guān)系。不同貯藏方式對(duì)球蛋白表面疏水性的影響變化如圖5所示。

由圖5可知，不同貯藏溫度下，室溫四種貯藏方式（真空、N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆與新鮮綠豆相比，球蛋白表面疏水性差異顯著（P＜0.05），原因是球蛋白發(fā)生氧化后，其α-螺旋增加，球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生收縮，形成了不溶的聚集體，使暴露的疏水性基團(tuán)被掩埋[24]；氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白表面疏水性差異顯著（P＜0.05），原因是氣調(diào)貯藏對(duì)球蛋白結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，而真空條件下球蛋白氧化程度大于氣調(diào)條件，球蛋白分子內(nèi)部形成的不溶性聚集體增加，導(dǎo)致其表面疏水性也差異顯著（P＜0.05）。4 ℃條件貯藏下的綠豆與新鮮綠豆相比，氣調(diào)貯藏（N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆球蛋白表面疏水性差異不顯著（P＞0.05），且相較室溫貯藏，4 ℃貯藏后的綠豆球蛋白表面疏水性下降較小，原因是4 ℃貯藏有延緩氧化的作用，球蛋白內(nèi)大分子聚集體的生成減少，也會(huì)影響其表面疏水性的降低；氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白表面疏水性差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明4 ℃和氣調(diào)貯藏都起保護(hù)球蛋白結(jié)構(gòu)的作用，減少了球蛋白分子內(nèi)部形成的不溶性聚集體，從而減小對(duì)暴露的疏水性基團(tuán)作用。Ye等[25]研究發(fā)現(xiàn)，花生蛋白發(fā)生氧化，其表面疏水性逐漸下降，本研究通過(guò)對(duì)綠豆球蛋白溶解性及表面疏水性的變化研究，得到球蛋白氧化程度增加，溶解度降低，表面疏水性也降低，與文獻(xiàn)中結(jié)果一致。

圖5 貯藏方式對(duì)球蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of storage methods on the surface hydrophobicity of globulin

2.1.5 貯藏方式對(duì)球蛋白SDS-PAGE的影響變化本文在制備綠豆球蛋白過(guò)程中沒有采用色譜分離技術(shù)進(jìn)一步純化，所以球蛋白電泳圖中可能含有少量清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的亞基條帶，不同貯藏條件球蛋白的SDS-PAGE電泳圖如圖6所示。

由圖6可知，不同貯藏方式的電泳圖中亞基數(shù)目沒有變化，表明不同貯藏方式下的綠豆球蛋白亞基數(shù)目沒有改變，但是由于貯藏條件的不同，綠豆球蛋白的亞基條帶都發(fā)生了不同程度的變化。泳道1、3、5在40 kDa出現(xiàn)明顯的條帶，推測(cè)的原因是蛋白質(zhì)分子之間的二硫鍵具有一定程度的聚集和交聯(lián)[26]；泳道1、3、5、7的14 kDa條帶顏色變淺模糊，其中泳道7整個(gè)條帶變淺，這可能是因?yàn)樵谶€原態(tài)電泳中，β-巰基乙醇的加入打斷了大分子蛋白聚集體中的二硫鍵[16]，此時(shí)球蛋白發(fā)生變性；且與對(duì)照組相比，所有泳道頂端濃縮膠顏色有不同程度的加重，寬窄也有不同變化，說(shuō)明不同貯藏方式下大分子物質(zhì)均發(fā)生了聚集；同時(shí)，蛋白質(zhì)氧化的加深也會(huì)引起某些蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解，從而在低分子量區(qū)域產(chǎn)生離散不均勻的條帶[27]。吳偉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，米糠在貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化形成聚集體，并且二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵共同參與其形成。泳道4、6、8與對(duì)照組條帶相似；說(shuō)明此三種貯藏條件下，綠豆球蛋白結(jié)構(gòu)變化較小，與前文結(jié)果相同。

圖6 不同貯藏方式下綠豆球蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of mung bean globulin under different storage methods

2.2 貯藏方式對(duì)球蛋白溶解性的影響變化

溶解度是表征蛋白質(zhì)質(zhì)變的重要特征。通過(guò)對(duì)球蛋白溶解度的變化明確其結(jié)構(gòu)品質(zhì)的變化帶動(dòng)功能性質(zhì)的變化。采用Folin酚法對(duì)不同貯藏方式下綠豆球蛋白的溶解度進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定結(jié)果變化如圖7所示。

由圖7可知，不同貯藏溫度下，室溫四種貯藏方式（真空、N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆與新鮮綠豆相比，球蛋白溶解度差異顯著（P＜0.05），原因是貯藏中球蛋白的氧化作用使球蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，球蛋白內(nèi)部形成較大分子量的聚集體，導(dǎo)致其溶解性下降[29]，氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白溶解性差異顯著（P＜0.05），原因是真空條件下球蛋白結(jié)構(gòu)氧化更嚴(yán)重，大分子聚集體生成更多。4 ℃條件貯藏下的綠豆與新鮮綠豆相比，氣調(diào)貯藏（N2+CO2、CO2、N2）后的綠豆球蛋白溶解度差異不顯著（P＞0.05），且相較室溫貯藏，4 ℃貯藏后的綠豆球蛋白溶解度下降較小，原因是4 ℃貯藏有延緩球蛋白氧化的作用，抑制球蛋白不溶性聚集體的生成，從而減少溶解度的下降；氣調(diào)與真空貯藏的綠豆球蛋白溶解性差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明綠豆在經(jīng)4 ℃和氣調(diào)貯藏后，球蛋白的氧化作用都受到抑制，球蛋白結(jié)構(gòu)收縮變少，導(dǎo)致溶解性下降不顯著（P＞0.05）。研究[16]發(fā)現(xiàn)，大米谷蛋白中α-螺旋含量的變化與谷蛋白的溶解性呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），根據(jù)本研究對(duì)綠豆球蛋白α-螺旋和溶解性的研究，得到α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，溶解度降低，與報(bào)道中相同。

圖7 貯藏方式對(duì)球蛋白溶解性的影響Fig.7 Effect of storage methods on the solubility of globulin

2.3 球蛋白結(jié)構(gòu)與溶解性的相關(guān)性分析

學(xué)者對(duì)大豆vicilin球蛋白研究發(fā)現(xiàn)，球蛋白的結(jié)構(gòu)特征和理化功能性質(zhì)之間存在一定的相關(guān)性[29-30]。不同貯藏方式下，綠豆球蛋白的結(jié)構(gòu)與溶解性均發(fā)生了變化，利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析了兩者之間的相關(guān)性如表2所示，由表2可知，球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)與球蛋白的溶解性呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；β-折疊結(jié)構(gòu)與溶解性呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與球蛋白溶解性呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；而無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)與球蛋白的功能性質(zhì)沒有相關(guān)性；巰基與球蛋白溶解性呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；二硫鍵與球蛋白溶解性呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；表面疏水性與溶解性呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。研究表明大多數(shù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，可歸因于α-螺旋的增加或減少，因?yàn)棣?螺旋主要起到維持蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的作用[27]。

表2 貯藏過(guò)程中球蛋白結(jié)構(gòu)與溶解性的相關(guān)性Table 2 Correlation between globulin structure and solubility during storage

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)不同溫度與方式貯藏的綠豆，其球蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性都發(fā)生了變化，不同貯藏方式引起的變化也有所不同。經(jīng)4 ℃氣調(diào)貯藏后綠豆，其球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)、巰基、二硫鍵、表面疏水性、溶解性與新鮮綠豆球蛋白相比差異均不顯著（P＞0.05），且變化都較室溫貯藏后的綠豆球蛋白變化幅度小，并且球蛋白的結(jié)構(gòu)與其溶解性具有極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），由此4 ℃氣調(diào)貯藏會(huì)相對(duì)減少綠豆球蛋白的結(jié)構(gòu)變化與性質(zhì)變化，是綠豆球蛋白的理想保存方式。本研究對(duì)于真空貯藏與氣調(diào)貯藏的區(qū)別沒有得到滿意的答案，而貯藏過(guò)程中氣體對(duì)于綠豆球蛋白結(jié)構(gòu)所起的作用也未有明確的研究結(jié)果，因此關(guān)于貯藏過(guò)程中氣體對(duì)球蛋白的保護(hù)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。