不同致病性的麥根腐平臍蠕孢菌代謝組學(xué)分析

張 琳，楊 軻，汪軍成，姚立蓉，司二靜，馬小樂，李葆春，尚勛武，王化俊，孟亞雄

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana，有性態(tài)為Cochliobolus sativus）屬半活體營養(yǎng)型植物病原菌，可引起小麥、大麥、燕麥及水稻等多種禾本科作物葉斑病害[1-3]。樊學(xué)廣等[4]研究發(fā)現(xiàn)，麥根腐平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病可導(dǎo)致小麥生長緩慢，產(chǎn)量降低，減產(chǎn)幅度達(dá)10%～50%，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。于靜[5]研究了由麥根腐平臍蠕孢引起的玉米麥根腐平臍蠕孢葉斑病，發(fā)現(xiàn)病原體通過侵染玉米葉面，使光合作用減弱，嚴(yán)重影響玉米吸收養(yǎng)分，導(dǎo)致玉米質(zhì)量下降。龐云星等[6]研究發(fā)現(xiàn)，麥根腐平臍蠕孢菌侵染大麥可引起根腐病和黑胚病，一般而言，葉斑病流行的年份黑胚病也危害嚴(yán)重，這是導(dǎo)致大麥減產(chǎn)和品質(zhì)嚴(yán)重降低的重要原因。

由于麥根腐平臍蠕孢菌對作物具有較大破壞性、毀滅性以及難防治性。因此，對麥根腐平臍蠕孢菌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和致病機(jī)制的研究具有十分重要的意義。陳琳等[7]為探索引起麥根腐平臍蠕孢菌致病性變異及其寄主?；缘脑颍靡合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）和非標(biāo)記定量技術(shù)對分離來自大麥和小麥的毒性差異菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，獲得了差異表達(dá)蛋白。魏玲玲等[8]利用廣泛靶向代謝組技術(shù)，分析對白粉病不同抗性青稞葉片中的代謝物，為揭示青稞抗白粉病的代謝機(jī)制提供了理論支撐。史懷等[9]通過代謝組學(xué)方法，對不同致病性青枯雷爾氏菌的胞外代謝物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，這些代謝標(biāo)志物可能與青枯雷爾氏菌的致病性有關(guān)。因此，通過代謝組學(xué)分析不同致病性麥根腐平臍蠕孢菌，明確其致病性差異原因?qū)ζ洳『Φ姆乐斡兄匾囊饬x，但不同致病性麥根腐平臍蠕孢菌的代謝組學(xué)分析尚未見報道。

本研究通過大麥葉斑病苗期侵染型分級標(biāo)準(zhǔn)測定了麥根平臍蠕孢菌弱致病性菌株ND-85 和強(qiáng)致病性菌株ND-87 的致病性，而后采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)和多元統(tǒng)計分析方法，分析2 株菌株的差異代謝物，結(jié)合KEGG 分析研究其代謝通路富集情況，通過從代謝組學(xué)分析2 株菌株存在致病力差異的原因，旨在為研究不同麥根腐平臍蠕孢菌的致病力差異奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大麥葉斑病感病品種為蒙啤麥1 號，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類課題組提供。

弱致病性麥根腐平臍蠕孢菌菌株ND-85 和強(qiáng)致病性麥根平臍蠕孢菌菌株ND-87 由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類課題組鑒定并保存。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉17 g、葡萄糖20 g，1 L 去離子水。121 ℃滅菌20 min 備用。LB 培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，10 g 氯化鈉，5 g 酵母粉，調(diào)pH 值至7.0～7.5，倒入適量蒸餾水溶解混勻，定容到1 L。于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

將土、沙、蛭石以1∶1∶1（體積比）混合均勻，高壓滅菌。大麥種子用5%次氯酸鈉溶液和70%酒精溶液，然后用蒸餾水沖洗3～5 次，繼續(xù)溫水浸種0.5 h。在培養(yǎng)皿中發(fā)芽5～7 d，移栽到直徑7 cm 的小花盆中，每個花盆5 穴，每穴3 粒，在22 ℃的溫室中培養(yǎng)。

挑取在4 ℃保存的菌株ND-85 和ND-87 接種于PDA 培養(yǎng)基上，放置在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)10 d 后，用含0.25%Tween 20 的ddH2O 沖刷菌落，用紗布過濾菌液備用。待蒙啤麥1 號植株長至兩葉一心期（移栽后15 d），將濃度為1.0×104個/mL 麥根平臍蠕孢菌孢子懸浮液噴灑到葉片上，接種1 d，早晚噴施2 次，在接種期間溫室處于黑暗狀態(tài)，溫度22 ℃，濕度100%，以確保植株發(fā)病，對照則是在相同條件下生長不接菌的蒙啤麥1 號。從接菌后開始觀察植株葉片發(fā)病情況，發(fā)病等級的評定參照FETCH 等[10]和惠慧等[11]的方法，以此測定2 種菌株的致病力。

1.3 樣本制備和代謝物提取

挑取在4 ℃保存的菌株ND-85 和ND-87 接種于PDA 培養(yǎng)基上，放置在25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待菌株培養(yǎng)10 d，分離2 種菌株的孢子，方法如下：在超凈工作臺中用挑菌器挑取菌株放于無菌LB培養(yǎng)基中，置于搖床25 ℃180 r/min 條件下培養(yǎng)，待出現(xiàn)病原菌孢子時將其在無菌環(huán)境下進(jìn)行過濾，期間用ddH2O 進(jìn)行反復(fù)沖洗，用無菌濾紙吸干水分，收集孢子。樣本制備各設(shè)置6 個重復(fù)，密封保存于2 mL 離心管放至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

按照DUNN 等[12]與EVA 等[13]的方法，將樣本于液氮中研磨；取50 mg 樣本于2 mL 離心管中加入1 000 μL甲醇（-20 ℃），渦旋振蕩1 min；12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液450 μL 至2 mL 離心管中，采用真空濃縮儀濃縮至盡干；加入150 μL的80%甲醇配置的2-氯苯丙氨酸溶液（0.004 g/L）（-20 ℃保存）復(fù)溶樣品，經(jīng)過0.22 μm 膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中。從每個待測樣本各取20 μL混合成QC樣本（QC，Quality control，用來校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤），用剩余待測樣本進(jìn)行LC-MS 檢測[14]。

1.4 代謝物檢測

LC-MS 采用UltiMate 3000Q（ThermoFisher Scientific，USA）和Exactive 高分辨質(zhì)譜儀（ThermoFisher Scientific，USA）來進(jìn)行代謝物的分離和檢測，所用色譜柱為UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters）[15]。質(zhì)譜試驗使用ThermoQExactive，電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子電離模式，同時采用動態(tài)排除法去除不必要的MS/MS 信息[16]。

1.5 代謝物的鑒定和分析

使用Proteowizard（v3.0.8789）將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzXMLformat，然后使用R 包XCMS（v3.1.3）軟件進(jìn)行分析，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫與軟件自建數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行定性，利用歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行多元統(tǒng)計分析：主成分分析（PCA 分析）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA 分析）和篩選差異代謝物（變量權(quán)重值VIP≥1 且t 檢驗P 值＜0.05），然后對差異代謝物進(jìn)行聚類熱圖分析和代謝通路KEGG 富集分析（t 檢驗P 值＜0.05）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力分析

研究將菌株ND-85 和ND-87 接種于蒙啤麥1 號，觀察植株葉片發(fā)病情況，接菌36 h 后發(fā)現(xiàn)，蒙啤麥1 號的葉片表型有差異，參考Fetch 標(biāo)準(zhǔn)，ND-85 病斑較多，病斑呈現(xiàn)褐色或淺褐色，多為橢圓或長橢圓形，病斑中等大小，周圍具有明顯的彌散狀的褪綠暈圈，病斑間褪綠暈圈不連片，侵染等級屬于6 級（圖1-A）；ND-87 病斑大且較多，褐色至深褐色，長橢圓或長條形，沿葉脈縱向擴(kuò)展，周圍具有明顯的彌散狀褪綠暈圈，病斑連片居多，屬于Fetch 標(biāo)準(zhǔn)的第8 等級（圖1-B）。表明菌株ND-85與菌株ND-87 致病力存在明顯差異，測定ND-85為弱致病性菌株，ND-87 為強(qiáng)致病性菌株。

2.2 代謝物定性定量分析

2.2.1 代謝物定性分析 菌株ND-85 和ND-87 共檢測出11570 種物質(zhì)，正離子代謝物質(zhì)包括8110 種，負(fù)離子代謝物質(zhì)3 460 種，其中鑒定到的已知代謝物是2 223 種，但有9 347 種代謝物尚未定性。對2 個菌株的已知代謝物進(jìn)行聚類分析，得到136 類代謝物，如圖2-A 所示，羧酸及其衍生物有258 種；苯及其取代衍生物有185 種；脂肪酰類物質(zhì)有162 種；有機(jī)氧化合物包括152 種；90 種類固醇及類固醇衍生物；78 種脂質(zhì)類物質(zhì)；44 種酚類物質(zhì)；38 種吲哚類和衍生品；37 種吡啶和衍生品；咪唑嘧啶類物質(zhì)和有機(jī)氮類化合物36 種；28 種二嗪類物質(zhì)；27 種酮酸及其衍生物；25 種喹啉及衍生品和類黃酮類物質(zhì)；21 種唑類物質(zhì)；20 種羥基酸及其衍生物和異黃酮類物質(zhì)；19 種蝶啶和衍生品；18 種肉桂酸及其衍生物和嘌呤核苷；15 種嘧啶核苷酸；14 種萘和香豆素及衍生品；13 種有機(jī)磷酸及其衍生物、碳水化合物和碳水化合物結(jié)合物和嘌呤核苷酸；12 種酚醚類物質(zhì)；11 種對稱二苯代乙烯和線性1，3-二芳基丙烷；9 種甘油磷脂、苯丙酸、苯基丙酸和異喹啉和衍生物；8 種苯噻嗪和內(nèi)酯類物質(zhì)；7 種5′-脫氧核苷、嗎啡、二元胺、內(nèi)酰胺和羰基化合物；6 種哌啶、苯并吡喃、苯丙氮類物質(zhì)、嘧啶核苷和苯二氮平類藥物；醇類和多元醇、菲和衍生物、四吡咯和衍生物各5 種；育亨賓類生物堿、三聯(lián)苯、肽類、生物堿、苯并咪唑、有機(jī)硫代磷酸及其衍生物各4 種；氮雜環(huán)丙烷、吡咯、四環(huán)素、黃素核苷酸、丁烷木酚素、蒽、苯并二惡茂烷、糠醛、有機(jī)磺酸及其衍生物、有機(jī)膦酸及其衍生物各3 種；噻二嗪、核苷和核苷類似物、生物堿、鞘脂類等26 類物質(zhì)各2 種；二氧吡咯、內(nèi)源性大麻素、苯噻嗪類、木酚素內(nèi)酯等46 類物質(zhì)各1 種。菌株ND-85、菌株ND-87 的代謝物分類相同，故需進(jìn)一步對2 種菌株的代謝物進(jìn)行定量分析。

2.2.2 代謝物樣本質(zhì)控分析 PCA 主要用于觀察樣本組間分離趨勢以及是否有異常點(diǎn)出現(xiàn)，同時從原始數(shù)據(jù)上反映組間和組內(nèi)的變異度[18-19]。QC 工作是進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究時獲得可靠且高質(zhì)量的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，本研究對試驗樣本菌株ND-85、ND-87 和質(zhì)控樣本QC 進(jìn)行主成分分析（PCA）。由圖2-B 可得，通過觀察質(zhì)控樣本間的離散度，質(zhì)控樣本QC 相對于試驗樣本聚集，且質(zhì)控樣本QC 誤差在小于2 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，表明本試驗LC-MS 檢測的系統(tǒng)誤差在可控范圍內(nèi)，可以得知儀器分析的穩(wěn)定性和可靠性，進(jìn)行下一步試驗。

2.2.3 代謝物定量分析 利用Proteowizard 軟件（v3.0.8789）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式利用R（v3.1.3）的XCMS 程序包進(jìn)行分析鑒定。首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行確認(rèn)（分子量誤差≤15 mg/kg（質(zhì)量偏差值）），后續(xù)根據(jù)MS/MS 碎片模式比對Human Metabolome Database（HMDB）得出表1，其鑒定得到的正負(fù)模式代謝物為11 570 種，已知代謝物有2 223 種，利用二級譜圖鑒定到的物質(zhì)有521 種，利用一級譜圖鑒定到的物質(zhì)共1 702 種，未知代謝物有9 347 種。

表1 代謝物鑒定結(jié)果 種

2.2.4 代謝物聚類熱圖分析 將表1 中11 570 種代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行以2 為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換和z-score 標(biāo)準(zhǔn)化（zero-mean normalization）處理，然后進(jìn)行層次聚類分析，采用歐氏距離進(jìn)行計算，如圖2-C 所示，菌株ND-87 和ND-85 高表達(dá)量的代謝物之間存在明顯差異代謝物。

2.3 多元統(tǒng)計分析

利用SIMCA-P 軟件，將菌株ND-85 和ND-87的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后建模，而后對結(jié)果進(jìn)行主成分PCA分析（圖3-A），以反映菌株ND-85、ND-87 代謝物的相似性和差異性。由圖3-A 可知，菌株ND-85 與菌株ND-87 在第1 主成分（PC1）上有明顯分離，二者表現(xiàn)在組間出現(xiàn)分離趨勢，在第1 主成分（PC1）、第2 主成分（PC2）表現(xiàn)出組內(nèi)聚集趨勢。其中，第1 主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為25.7%，而第2 主成分（PC2）貢獻(xiàn)率則為12.5%，二者累計貢獻(xiàn)率達(dá)到38.2%，表明菌株ND-85 與菌株ND-87代謝調(diào)控不同。

2.3.1 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）正交偏最小二乘判別分析是代謝組數(shù)據(jù)分析中常用的分析方法，是PLS-DA 的擴(kuò)展[20]。圖3-B 為OPLSDA 得分圖，結(jié)果與PCA 結(jié)果大體一致。評價OPLSDA 模型的預(yù)測參數(shù)有R2X、R2Y 和Q2，這3 個指標(biāo)越接近1 表明模型越穩(wěn)定可靠。結(jié)果顯示，OPLSDA 模型穩(wěn)定性良好且預(yù)測能力較強(qiáng)，后續(xù)的模型檢驗和差異代謝物篩選用OPLS-DA 結(jié)果可以進(jìn)行分析。并且菌株ND-85 與菌株ND-87 之間完全不重合，表明2 種菌株的代謝模式存在差異。

2.3.2 差異代謝物篩選 結(jié)合多元統(tǒng)計分析正交偏最小二乘判別分析的變量權(quán)重值（VIP 值）和t 檢驗來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物，探討不同致病性菌株代謝途徑的變化。顯著差異的閾值為：VIP≥1 且t 檢驗的P＜0.05。如圖4-A 所示，從11 570 代謝物中篩選差異代謝物，篩選出726 種重疊的差異代謝物，菌株ND-85 與菌株ND-87 相比差異代謝物有458 種下調(diào)，主要包括有機(jī)酸、酯類物質(zhì)等，而有268 種差異代謝物上調(diào)，主要包括氨基酸、有機(jī)酸、硒等。

2.3.3 差異代謝物聚類熱圖 將比較2 個菌株組間的差異代謝物進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化后進(jìn)行聚類分析并作圖，可直觀展示差異代謝物在比較組中的積累差異，如圖4-B 所示，菌株ND-85 與菌株ND-87 有明確的高或者低表達(dá)區(qū)域，差異代謝物表達(dá)量高的區(qū)域或表達(dá)量低的區(qū)域整體不同，且菌株ND-85 的上調(diào)差異代謝物較多，菌株ND-87 的下調(diào)差異代謝物較多。

2.4 代謝通路分析

2.4.1 代謝物KEGG 注釋 在KEGG 代謝物數(shù)據(jù)庫檢索菌株ND-85 與菌株ND-87 所得代謝物進(jìn)行KEGG 注釋，分為6 大功能類別，其中，參與新陳代謝功能過程的有85 種代謝通路包括1 730 種代謝物；參與人類疾病功能過程有3 種代謝通路包括15 種代謝物；參與環(huán)境信息加工過程有2 種代謝通路包括67 種代謝物；參與遺傳信息轉(zhuǎn)化功能過程有2 種代謝通路包括36 種代謝物；參與細(xì)胞加工過程包括2 種代謝通路包括33 種代謝物；參與生物系統(tǒng)功能過程只有1 種代謝通路包含1 種代謝物，共2856 種代謝物。

如圖4-C 所示，菌株ND-85 與菌株ND-87 對比分析得到的差異代謝物分為4 大類別，即新陳代謝功能、人類疾病功能、環(huán)境信息加工過程和遺傳信息轉(zhuǎn)化過程，其中，參與新陳代謝功能過程有63 種代謝通路，包括276 種代謝物；人類疾病功能過程的僅有耐萬古霉素合成1 種代謝通路，包括2 種代謝物；參與環(huán)境信息加工過程的通路包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成通路，包括10 種代謝物；參與遺傳信息轉(zhuǎn)化過程的有tRNA-氨?；锖铣梢环N代謝通路，包括7 種代謝物，共295 種差異代謝物，其中明顯上調(diào)的代謝物包括89 種，如羥基酸及其衍生物、二氫呋喃、羧酸及其衍生物等，明顯下調(diào)的代謝物包括206 種，如羧酸及其衍生物、酚類化合物、羥基酸及其衍生物等。

2.4.2 差異代謝物KEGG 分析 取2 個菌株差異代謝物的66 類代謝通路中的前20 種代謝通路進(jìn)行分析，如圖4-C 所示，得到新陳代謝功能類的17 種代謝途徑包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的生物合成，酮體的合成與降解，淀粉和蔗糖生物合成，鞘脂類代謝等，有羧酸及其衍生物、有機(jī)氮化合物等代謝物；遺傳信息轉(zhuǎn)化過程有tRNA-氨?；锖铣赏緩?，主要代謝物有羧酸及其衍生物；環(huán)境信息加工過程包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成途徑，主要代謝物有有機(jī)氮化合物；人類疾病功能過程包括耐萬古霉素類物質(zhì)的合成途徑，主要代謝物是酮酸及其衍生物。

由表2 可知，其中有7 條代謝通路顯著變化（P＜0.05，VIP≥1）包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，賴氨酸降解，酮體的合成與降解，氰胺基酸代謝，淀粉和蔗糖的代謝，tRNA-氨酰生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝。由圖5 可知，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的生物合成通路富集最為顯著，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及精氨酸和脯氨酸的代謝合成途徑富集程度較高。

表2 ND -85 -vs -ND -87 的通路富集分析

3 結(jié)論與討論

3.1 菌株致病力分析

本研究利用大麥葉斑病感病材料蒙啤麥1 號，在相同條件下分別接種菌株ND-85 和ND-87，根據(jù)大麥葉斑病苗期侵染型分級標(biāo)準(zhǔn)觀察不同菌株侵染下的植株葉片發(fā)病情況，以此來測定菌株致病性的強(qiáng)弱，結(jié)果表明，2 種菌株致病力存在明顯差異。姚全杰等[21]的研究結(jié)果表明，同一大麥種質(zhì)對不同菌株的抗性水平有所不同，這與本研究的結(jié)果相似。但導(dǎo)致不同菌株致病性差異的原因研究較少，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 差異代謝物分析

代謝組學(xué)是對某一生物或細(xì)胞在特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進(jìn)行定性定量分析的一門新學(xué)科，在代謝途徑解析中發(fā)揮了重要作用[22]。WANG 等[23]采用廣泛靶向代謝組學(xué)方法，分別對鹽地堿蓬和歐洲海蓬子葉片中822、694 個代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，為今后這2 種植物的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本試驗共從菌株ND-85 和ND-87檢測出11570 種物質(zhì)，正離子代謝物質(zhì)包括8110 種，負(fù)離子代謝物物質(zhì)3 460 種，其中，鑒定到的已知代謝物是2 223 種，但有9 347 種代謝物尚未定性。對2 個菌株的已知代謝物進(jìn)行聚類分析，得到136 類代謝物。但由于代謝物種類較多，比較發(fā)現(xiàn)，2 種菌株代謝物定性沒有明顯差異，需進(jìn)一步對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析來明確其差異原因。霍冬敖等[24]利用正交偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)，從野生韭籽和栽培韭籽中共篩選出12 類顯著變化的差異代謝物，共計492 種。本研究利用相同方法對菌株ND-85 和ND-87 的代謝物進(jìn)行分析，共篩選出726 種重疊的差異代謝產(chǎn)物，有458 種差異代謝物下調(diào)，主要包括有機(jī)酸、酯類物質(zhì)等；有268 種差異代謝物上調(diào)，主要包括氨基酸、有機(jī)酸、硒等。前人研究結(jié)果表明，一氧化氮對植物病原真菌炭疽菌（Colletotrichum coccodes）和白粉菌（Blumeria graminis）的分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成具有調(diào)控作用，而精氨酸作為一氧化氮的前體在此過程中起著關(guān)鍵作用[25]。CHEN 等[26]通過比較禾谷鐮刀菌野生株基因缺失突變體的代謝組發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸和氨基酸的代謝存在著顯著差異。而在本研究中，菌株ND-85 和ND-87的差異代謝物包括有機(jī)酸和氨基酸，因此，推測菌株ND-85 和ND-87 的致病性差異與有機(jī)酸和氨基酸的代謝有關(guān)。

3.3 差異代謝通路分析

對KEGG 分析得到的66 條代謝通路進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，賴氨酸降解，酮體的合成與降解，氰胺基酸代謝，淀粉和蔗糖的代謝，tRNA-氨酰生物合成，精氨酸和脯氨酸的代謝這7 種代謝通路有顯著差異，其中，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸生物合成通路的富集最為顯著，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成途徑的富集程度最高。因此，推測耐萬古霉素類生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成、tRNA-氨酰生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代謝、賴氨酸降解途徑都是影響致病性的因素。

楊玉宏等[27]研究結(jié)果表明，氨酰-tRNA 合成酶（AaRS）是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成途徑中的一類關(guān)鍵酶，該酶不僅與傳染病、癌癥和自身免疫疾病有關(guān)，而且還與其他多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。因此，氨酰-tRNA 合成酶是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成途徑中的一類關(guān)鍵酶，在真菌上該酶也會導(dǎo)致植株產(chǎn)生病害[28]。環(huán)境信息加工過程包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成途徑，主要代謝物有有機(jī)氮化合物。秦鵬等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路隨著發(fā)酵時間的增加而變?yōu)橄x草素調(diào)控的樞紐，可能與高產(chǎn)蟲草素蛹蟲草菌對蟲草素的自我解毒能力有關(guān)。此外，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路可將菌株釋放的防御物質(zhì)變?yōu)闊o毒化合物，從而有利于病原菌侵入寄主，因此，其與菌株的致病性相關(guān)[30]。人類疾病功能過程包括耐萬古霉素類物質(zhì)的合成途徑，主要代謝物是酮酸及其衍生物。孫瑯[31]研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌存在固有耐藥和獲得性耐藥，導(dǎo)致其對很多常用抗菌藥物耐藥。說明萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌對抗菌的物質(zhì)表現(xiàn)一定的抗性，從而促進(jìn)病原菌的致病性。

本研究首先通過大麥葉斑病苗期侵染型分級標(biāo)準(zhǔn)鑒定測定強(qiáng)致病性菌株ND-85、弱致病性菌株ND-87，進(jìn)一步對菌株ND-85、菌株ND-87 代謝物定性分析，發(fā)現(xiàn)2 種菌株次生代謝物種類沒有明顯的差別，通過定量分析鑒定到已知次生代謝物質(zhì)是2 223 種，仍有9 347 種代謝產(chǎn)物尚未確定其分子特征。主成分分析（PCA）顯示，菌株ND-85 和菌株ND-87 間分散明顯，正交偏最小二乘法判別分析得出，菌株ND-85 和菌株ND-87 共有726 種重疊的差異代謝產(chǎn)物，差異代謝物相比有458 種下調(diào)，268 種上調(diào)。通過對差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行KEGG 注釋得出66 類代謝通路，進(jìn)而通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，7 條代謝通路顯著變化，其中甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的生物合成通路的富集最為顯著，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成途徑富集程度最高。綜上所述，推測導(dǎo)致大麥葉斑病的不同麥根腐平臍蠕孢菌的致病力差異的原因與耐萬古霉素類生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成、tRNA-氨酰生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代謝、賴氨酸降解途徑有關(guān)，該試驗結(jié)果為研究不同麥根腐平臍蠕孢菌的致病力差異奠定了基礎(chǔ)。