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    甘薯IbWRKY44 的克隆與表達分析

    2021-12-16 03:37:24趙彩良呂運韜董靜靜劉世芳賈小云
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:甘薯擬南芥花青素

    趙彩良,常 璐,呂運韜,張 潔,董靜靜,劉世芳,賈小云

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801;3.臨沂市河?xùn)|區(qū)湯泉高級中學(xué),山東臨沂 276027)

    甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)塊根富含多種營養(yǎng)成分如維生素、蛋白質(zhì)以及花青素、類胡蘿卜素等,是重要的糧食作物。甘薯的種植具有操作簡單、成本低、產(chǎn)量高等特點,其產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米[1]。

    花青素屬于類黃酮物質(zhì),是一種水溶性的可食用色素,存在于植物液泡中且在不同pH 條件下呈現(xiàn)粉色、紅色、藍色、紫色等顏色[2]?;ㄇ嗨夭粌H可以幫助植物抵抗不良的外界環(huán)境、吸引昆蟲傳播花粉,還在人類的醫(yī)療保健方面發(fā)揮著重要作用,如具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能[3-5]?;ㄇ嗨氐纳锖铣墒艿蕉喾N因素的調(diào)節(jié),包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、環(huán)境因子(光照、溫度、糖、激素、pH、干旱、肥料、病害等)以及microRNA 等。結(jié)構(gòu)基因是指編碼花青素生物合成途徑中的酶基因,包括CHS(查爾酮合成酶)、CHI(查爾酮異構(gòu)酶)、F3H(黃烷酮-3-羥化酶)、DFR(二羥基黃酮醇還原酶)、ANS(花色素合成酶)和UFGT(類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶)等。調(diào)節(jié)基因主要包括MYB、bHLH 和WD40 三類轉(zhuǎn)錄因子,它們通過形成MBW 復(fù)合體來參與調(diào)控花青素的生物合成。近年來也發(fā)現(xiàn)許多其他類型的轉(zhuǎn)錄因子參與了花青素生物合成的調(diào)控,包括NAC、WRKY、AP2、SPL等。楊慧珍[6]研究表明,IbANS 在紫色甘薯的塊根、莖和葉中的表達量均顯著高于白色甘薯,可能參與花青素的合成。CHU 等[7]研究表明,過表達IbMYB1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥中花青素的含量上升且花青素合成相關(guān)基因CHI、F3′H、DFR 的表達量均上調(diào)。DONG等[8]的研究發(fā)現(xiàn),甘薯IbWD40 的表達量隨花青素的積累而升高。目前有關(guān)甘薯花青素的研究主要集中在MBW 復(fù)合體的調(diào)控機制上,而關(guān)于甘薯WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對花青素調(diào)控的研究鮮有報道。

    WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的N 端含有保守基序為WRKYGQK 的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域,C 端含有C2H2或C2HC 鋅指結(jié)構(gòu)[9-10]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子一般通過與基因啟動子中的W-Box 作用元件特異結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,進而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[10]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特征,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3 類,Group I 有2 個結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2;GroupⅡ和GroupⅢ均只有1 個結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2和C2HC。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域外的其他保守結(jié)構(gòu)基序,GroupⅢ成員可進一步分為IIa、IIb、IIc、IId 和IIe 等5 個亞類[9]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、新陳代謝、脅迫響應(yīng)及次生代謝中具有重要作用。擬南芥AtWRKY44 在毛狀體形成、花青素積累、種子色素沉著、胚乳發(fā)育、種子大小和根部有無毛細胞分化等生長發(fā)育進程中均發(fā)揮作用[11-15]。HAN 等[16]研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫下,GI-miRNA172E-AtWRKY44調(diào)控擬南芥的糖信號通路從而加速植株開花。王熙然[17]在草莓中過表達FaWRKY44 后,果實中花青素含量顯著上升,原花青素含量下降;而減低表達FaWRKY44 后,花青素含量顯著下降,原花青素含量顯著上升。CHENG 等[18]在紅火龍果中研究發(fā)現(xiàn),HpWRKY44 通過與HpCytP450-like1 啟動子中的W-Box 元件結(jié)合而激活其表達,二者在果實著色過程中含量逐步增加。楊樹等[19]研究發(fā)現(xiàn),丹參SmTTG2(SmWRKY44)的表達量隨著花和種子的發(fā)育逐漸升高,推測其參與丹參種子的發(fā)育及萌發(fā)過程。PENG等[20]研究發(fā)現(xiàn),獼猴桃的AcWRKY44 和AcMYBC1在煙草葉片中瞬時過表達會促進煙草葉片積累花青素,但在獼猴桃愈傷組織中穩(wěn)定過表達后會促使F3′5′H 和原花青素合成相關(guān)基因及原花青素含量升高,說明AcWRKY44 和AcMYBC1 在平衡花青素與原花青素的含量方面具有重要作用。煙草NtTTG2 通過調(diào)控NtARF8、NtARF17 和NtARF19進而影響煙草的生長發(fā)育[21]。目前尚未見到關(guān)于甘薯IbWRKY44 功能研究的相關(guān)報道。紫心甘薯塊根富含花青素,是研究植物地下器官中花青素生物合成調(diào)控機制的理想材料。

    本研究從紫心甘薯塊根中克隆了IbWRKY44,通過生物信息學(xué)分析和表達特性分析,初步探究了IbWRKY44 在花青素生物合成中的作用,并且成功構(gòu)建了融合表達載體,為深入解析甘薯IbWRKY44在甘薯塊根中花青素合成調(diào)控機制的研究提供參考依據(jù),對培育富含花青素的甘薯新品種具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    供試紫心甘薯有徐紫薯3 號(XZS-3)、徐紫薯8 號(XZS-8)和寧紫薯4 號(NZS-4),白心甘薯有徐薯18 號(XS-18)和薯綠1 號(SL-1),淡黃心品種高系14(GX-14),均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院徐州甘薯研究中心提供,種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)甘薯基地。本氏煙草(Nicotiana benthamiana Domin.)和Columbia型野生擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存,擬南芥T-DNA 插入突變體種子(SALK-206852C 和SALK-204777C)購自AraShare 網(wǎng)站(www.arashare.cn)。煙草和擬南芥植株種植于人工氣候培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為溫度26 ℃,光照16 h(光照強度125 mmol/(m2·s)),黑暗8 h,濕度50%。

    大腸桿菌菌株DH5α 和農(nóng)桿菌菌株GV3101均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存。

    1.2 RNA 的提取與cDNA 的合成

    取種植90 d 的XZS-3、XZS-8、NZS-4、XS-18、SL-1 和GX-14 的塊根,液氮研磨后用RNAiso Plus試劑提取RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀NanoDrop 2000C(Thermo Scientifc)檢測RNA 的完整性和質(zhì)量后,按照TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

    1.3 IbWRKY44 基因的克隆

    通過分析山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院賈小云課題組白心甘薯和紫心甘薯塊根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),找到在紫心甘薯中高表達而在白心甘薯中低表達的序列(Tai6.25536.1),經(jīng)序列同源性比對,與擬南芥AtWRKY44 的相似性最高,命名為IbWRKY44。設(shè)計含有KpnⅠ(GGTAC|C)和SalⅠ(G|TCGAC)酶切位點的克隆引物(IbWRKY44-PF-KpnⅠ:GGGGTACC TTGAAGATGGAGATCAAAGAG;IbWRKY44-PRSalⅠ:GCGTCGACCCATCTCGGTTTTTGTCTG-AT),以XZS-3 塊根的cDNA 為模板進行PCR 擴增,擴增產(chǎn)物純化回收后與克隆載體PMD19-T 相連,獲得重組質(zhì)粒PMD19-T-IbWRKY44,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,在含氨芐青霉素(Amp)的固體培養(yǎng)基上挑選克隆進行PCR 鑒定,提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA后送上海生物工程有限公司(中國,上海)測序。

    1.4 IbWRKY44 的生物信息學(xué)分析

    通過在線軟件對IbWRKY44的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析,所用網(wǎng)址如表1 所示。

    表1 IbWRKY44 序列分析所用網(wǎng)址及功能

    1.5 IbWRKY44 的系統(tǒng)進化分析

    下載PlantTFDB 中注釋明確的擬南芥的69 個WRKY 家族成員的氨基酸序列,與IbWRKY44 的氨基酸序列利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同時,將NCBI 中與IbWRKY44 氨基酸序列相似度較高的牽?;?、番茄、大豆等12 個物種的WRKYs 序列和IbWRKY44 利用DNAMAN 和MEGA 軟件分別進行多序列比對和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

    1.6 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

    在甘薯基因組數(shù)據(jù)庫(https://ipomoea-genome.org/)中比對獲得IbWRKY44 基因的DNA 序列。下載IbWRKY44 基因起始密碼子ATG 上游1 600 bp的序列,通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html)進行啟動子順式作用元件分析。

    1.7 IbWRKY44 的表達模式分析

    根據(jù)IbWRKY44 的序列設(shè)計定量引物:qRTPCR-IbWRKY44-PF:CACCGTGCTATCCCGTTACA;qRT-PCR-IbWRKY44-PR:GCCTTCTGCCTCCAAT CCTT。以XZS-3、XZS-8、NZ-4、XS-18、SL-1 和GX-14 塊根的cDNA 為模板,運用BIO-RAD CFX 96 熒光定量儀對IbWRKY44 基因進行表達模式分析,IbActin 為內(nèi)參基因,每個樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)?;蛳鄬Ρ磉_量的計算采用2-ΔΔCt法,運用SPSS Statistics v23 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P<0.05)。

    1.8 IbWRKY44 融合表達載體的構(gòu)建

    將測序得到的IbWRKY44 序列去除終止密碼子后設(shè)計帶有SalⅠ酶切位點的后引物IbWRKY44-2PR-Sal Ⅰ:GCGTCGACTGATTTTTCCTTTGTGGC。以PMD19-T-IbWRKY44 質(zhì)粒DNA 為模板進行PCR 擴增,對擴增產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP 表達載體分別用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切,回收目的片段,T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α,挑選在添加卡那霉素(Kan)的LB 固體培養(yǎng)基上生長的克隆進行PCR 鑒定。提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA,用KpnⅠ和SalⅠ對質(zhì)粒進行雙酶切驗證,獲得35S::IbWRKY44::GFP 融合表達載體,4 ℃保存待用。

    1.9 IbWRKY44 的煙草亞細胞定位

    將空載體pCAMBIA1300-GFP 和構(gòu)建好的35S::IbWRKY44::GFP 融合表達載體分別通過熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101 中,挑取在含有50 μg/mLKan 和50 μg/mL 利福平(Rif)的固體LB培養(yǎng)基上的克隆,經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆后(35SF:GACGCACAATCCCACTATCC 和 IbWRKY44-2PR-SalⅠ),于50 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至OD600為0.6,4 ℃,12 000 r/min 離心10 min,棄上清收集菌體,用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸(MES)和100 μmol/L 乙酰丁香酮(AS)的懸浮液重懸菌體至OD600為0.2,室溫孵育4 h 后注射長勢一致的28 d 煙草葉片,培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3 d后撕取注射部位葉片,經(jīng)1 μg/mL 的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min 后在Leica 熒光正置顯微鏡488 nm 的波長下觀察綠色熒光。亞細胞定位的預(yù)測根據(jù)表1 所列網(wǎng)址進行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 IbWRKY44 基因的克隆

    以XZS-3 塊根cDNA 為模板獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶單一,大小約為1 400 bp,純化回收后與PMD19-T 克隆載體連接,得到的菌落PCR 檢測條帶也單一,且大小一致,約1 400 bp(圖1)。陽性菌落提取的質(zhì)粒DNA 經(jīng)測序后,得到長度為1 401 bp 的IbWRKY44 基因的ORF序列。

    2.2 IbWRKY44 序列的生物信息學(xué)分析

    SMART 網(wǎng)站對保守結(jié)構(gòu)域的分析顯示,Ib-WRKY44 的氨基酸序列中含有2 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域和2 個C2H2的鋅指結(jié)構(gòu),共466 個氨基酸(圖2)。ProtParam 分析顯示,IbWRKY44 蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量為51 083.08 u,分子式為C2192H3518N654O717S18,總原子數(shù)為7099,等電點為9.31,脂溶性指數(shù)為53.99,不穩(wěn)定系數(shù)為47.63,表明IbWRKY44 蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白。NetPhos 分析顯示,IbWRKY44存在67 個磷酸化修飾位點,其中,絲氨酸磷酸化位點有40 個,蘇氨酸磷酸化位點有23 個,酪氨酸磷酸化位點有4 個(圖3-A)。NetNGlyc 分析表明,IbWRKY44 在第36、64、266 個氨基酸位點的天冬酰胺可能存在3 個糖基化位點(圖3-B)。ProtScale分析結(jié)果表明,IbWRKY44蛋白的氨基酸分值介于-2.822~1.511 之間,且疏水區(qū)域的面積明顯大于親水區(qū)域,表明IbWRKY44蛋白為疏水性蛋白(圖3-C)。信號肽分析結(jié)果顯示,IbWRKY44蛋白沒有信號肽。TMHMM 分析結(jié)果表明,IbWRKY44 蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3-D)。Wolf Psort Prediction 結(jié)果顯示,IbWRKY44定位于細胞核內(nèi)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,IbWRKY44蛋白主要由α-螺旋(15.24%)、β折疊(3.65%)、無規(guī)則卷曲(70.39%)和延伸鏈(10.73%)組成(圖3-E)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn),該蛋白具有典型的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的4β 折疊結(jié)構(gòu)(圖3-F)。

    2.3 IbWRKY44 的系統(tǒng)進化分析與多序列比對

    采用鄰接法構(gòu)建IbWRKY44 與69 個擬南芥WRKYs 蛋白的進化樹,結(jié)果顯示(圖4),Ib-WRKY44 與擬南芥AtWRKY44 聚為一支。利用DNAMAN 軟件對IbWRKY44 與12 個物種的WRKY44 氨基酸序列進行多序列比對,結(jié)果顯示,序列相似度為61.38%,均含有2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域,且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2(圖5);物種間系統(tǒng)進化關(guān)系顯示,IbWRKY44 與同為旋花科的甘薯二倍體ItWRKY44 和牽牛InWRKY44 親緣關(guān)系最近,與葡萄VvWRKY44 親緣關(guān)系最遠(圖6)。

    2.4 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

    通過在線軟件PlantCARE 分析IbWRKY44 上游1 600 bp 啟動子序列的順式作用元件,結(jié)果顯示,序列中除含有TATA-box 和CAAT-box 等啟動子基礎(chǔ)元件外,還含有G-Box、GT1-motif、MRE 等光響應(yīng)元件,脫落酸響應(yīng)元件ABRE,乙烯響應(yīng)元件ERE 等元件,以及MYC、MYB、AP1 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(表2)。

    表2 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

    2.5 IbWRKY44 的表達特性分析

    IbWRKY44 在3 個紫心甘薯XZS-3、XZS-8 和NZS-4 和3 個非紫心甘薯XS-18、SL-1 和GX-14的塊根中的表達量有顯著差異。從圖7 可以看出,IbWRKY44 在不同甘薯品種中均表達,但在紫心甘薯中的表達量顯著高于非紫心甘薯,與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

    2.6 IbWRKY44 表達載體的構(gòu)建

    以PMD19-T-IbWRKY44 質(zhì)粒DNA 為模板的擴增產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP 表達載體經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ雙酶切,連接后轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α,提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA,用KpnⅠ和SalⅠ對質(zhì)粒進行雙酶切驗證(圖8),酶切獲得2 條預(yù)期條帶,一條為pCAMBIA1300-GFP 載體片段,另一條目的條帶與IbWRKY44 基因的PCR 產(chǎn)物大小一致,表明Ib-WRKY44 序列已連接到pCAMBIA1300-GFP 過表達載體,命名為35S::IbWRKY44::GFP 融合表達載體。

    2.7 IbWRKY44 的亞細胞定位

    亞細胞定位的預(yù)測結(jié)果顯示,IbWRKY44 基因位于細胞核。為驗證這一結(jié)果,本研究注射煙草葉片進行瞬時表達,觀察GFP 熒光部位。將DAPI 染色后的煙草葉片撕取表皮細胞,在488 nm 波長下觀察綠色熒光。由圖9 可知,轉(zhuǎn)化空載(pCAMBIA1300-GFP)的葉片細胞在細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜及細胞核中都存在綠色熒光,而轉(zhuǎn)化融合表達載體(35S::IbWRKY44::GFP)的葉片表皮細胞只在細胞核中有綠色熒光,表明IbWRKY44 蛋白定位于細胞核內(nèi),與預(yù)測結(jié)果一致。

    3 結(jié)論與討論

    WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物花青素及其他次生代謝物的合成,大麥HvWRKY23 可以與花青素合成通路基因HvPAL2、HvCHS1 的啟動子結(jié)合進而促進花青素的合成[22]。YU 等[23]研究發(fā)現(xiàn),丹參中SmWRKY1、SmWRKY7、SmWRKY19、SmWRKY29、SmWRKY45、SmWRKY52、SmWRKY56、SmWRKY58和SmWRKY68 可能參與酮和酚酸的合成。同時,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應(yīng)方面也發(fā)揮著重要作用,WEI 等[24]研究發(fā)現(xiàn),GmWRKY54 通過激活轉(zhuǎn)基因大豆ABA 和Ca2+信號通路的基因從而提高植物的抗旱性。張鵬飛[25]在棉花中發(fā)現(xiàn),枯萎病原菌和SA、ETH、JA 等激素的誘導(dǎo)能夠激活GhWRKY75基因的表達,進而調(diào)控植物對枯萎病的抗性。趙曾強等[26]研究發(fā)現(xiàn),過表達GhWRKY44 的煙草在枯萎病菌的侵染下能夠激活抗病相關(guān)基因的表達。此外,大量的研究還表明,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和衰老進程。ZHENG 等[27]在蘋果中發(fā)現(xiàn),MdWRKY9 通過抑制油菜素類固醇MdDWF4的轉(zhuǎn)錄,從而減少矮化調(diào)控因子油菜素類固醇的產(chǎn)生。擬南芥AtWRKY75 通過抑制下游基因的表達來調(diào)控根毛的發(fā)育[28]。

    本試驗從XZS-3 的塊根中克隆到IbWRKY44,其ORF 序列長度為1 401 bp,編碼的蛋白屬于GroupⅠ家族,鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2,含有2 個WRKY結(jié)構(gòu)域。IbWRKY44序列中含有67 個磷酸化位點和3 個糖基化位點,表明IbWRKY44 蛋白可能在蛋白激酶或糖基化作用的調(diào)控下,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期等方面發(fā)揮作用。本試驗預(yù)測的IbWRKY44蛋白的三級結(jié)構(gòu)中包括4 個β 折疊,與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的空間結(jié)構(gòu)相符。IbWRKY44的煙草亞細胞定位表明,該基因編碼的蛋白位于細胞核,在細胞核內(nèi)發(fā)揮功能。IbWRKY44與擬南芥WRKY 家族的AtWRKY44 親緣關(guān)系最近,在物種間的進化關(guān)系上與同屬旋花科的甘薯二倍體三葉裂薯ItWRKY44和牽牛InWRKY44 的親緣關(guān)系最近,表明IbWRKY44可能具有與AtWRKY44、ItWRKY44 和InWRKY44相似的功能。多序列比對結(jié)果表明,IbWRKY44與其他物種的WRKY44 均含有2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域,屬于Ⅰ類轉(zhuǎn)錄因子。

    IbWRKY44 的啟動子序列中包含脫落酸、乙烯、厭氧和光響應(yīng)誘導(dǎo)元件,表明脫落酸、乙烯、厭氧和光誘導(dǎo)響應(yīng)機制中的相關(guān)因子可被IbWRKY44 的啟動子激活或抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程,從而在植物的生長發(fā)育或在對環(huán)境的適應(yīng)機制中發(fā)揮作用;包含調(diào)節(jié)胚乳發(fā)育的元件,推測IbWRKY44 參與調(diào)控植物胚乳的發(fā)育,且調(diào)控機制可能與擬南芥AtWRKY44 類似;還含有AP1、MYB 和MYC 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,說明IbWRKY44 還可能受AP1、MYB 和MYC 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

    基因表達特性分析結(jié)果顯示,IbWRKY44 在紫心甘薯塊根中的表達量顯著高于非紫心甘薯,表明IbWRKY44 可能正調(diào)控甘薯塊根中花青素的合成。該結(jié)果為解析甘薯IbWRKY44 的功能提供了理論基礎(chǔ),豐富了甘薯花青素合成的潛在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),同時為紫心甘薯的分子育種提供了新的研究思路。為了深入研究IbWRKY44 在花青素合成中的功能及挖掘其他功能,后期將對構(gòu)建好的35S::IbWRKY44::GFP 過表達載體進行擬南芥的轉(zhuǎn)化,篩選得到T3純合且IbWRKY44 高表達的植株,并測定轉(zhuǎn)基因植株中花青素的含量與花青素合成相關(guān)基因的表達量;構(gòu)建CRISPR-IbWRKY44 敲除表達載體,將其與35S::IbWRKY44::GFP 過表達載體分別進行甘薯懸浮細胞的轉(zhuǎn)化,對得到的轉(zhuǎn)基因甘薯苗進行基因?qū)用娴蔫b定及表型觀察,移至試驗田中獲得薯塊,對薯塊進行表型觀察及測序分析。同時,篩選與IbWRKY44互作的蛋白,研究其作用機制。

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