不同光照條件對牛樟組培苗生長的影響

羅劍飄， 羅青文， 官錦燕， 黃海英， 陳雙艷， 譚嘉娜*

(1.廣東省生物工程研究所/廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東 廣州 510316； 2.廣東省生物工程研究所 湛江甘蔗研究中心，廣東 湛江 524000)

0 引言

【研究意義】牛樟(Cinnamomumkanehirae)為臺灣當?shù)靥赜谐＞G闊葉大喬木樹種，是臺灣5種高級闊葉木之一，樹干通直，樹體高聳，具有良好的觀賞價值，其木材富含松油醇，不易腐朽、蟲蛀，材質(zhì)細致，紋理交錯，且容易加工，為高級家具及木刻藝術(shù)品用材[1]。牛樟芝(Antrodiacamphorata)是目前發(fā)現(xiàn)僅有自然生長于牛樟中空樹干中的珍稀真菌，含有三萜、樟芝酸、雜多糖、超氧化物歧化酶、腺苷等多種活性物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、保護肝臟和增強免疫力等諸多藥效，自然界中數(shù)量稀少，價格昂貴[2-3]。臺灣牛樟低海拔的原生育地逐漸消失，加上牛樟木材的高經(jīng)濟價值，其族群遭到大量砍伐及嚴重盜采而日漸稀少，近20年來又因牛樟芝市場需求旺盛，成熟牛樟老木常遭盜采牛樟芝者挖洞損壞而加速衰老死亡，更加快了其族群數(shù)量的降低速度，早在1996年，牛樟被臺灣農(nóng)委會評定為“瀕臨絕滅”(endangered)等級植物[4]，急需開展保護和人工繁育?！厩叭搜芯窟M展】近年來牛樟的研究領(lǐng)域逐漸拓展，包含了資源調(diào)查[5-6]、引種[7]、造林[8-9]、內(nèi)生真菌[10-11]、病理病害[12-13]、扦插繁殖[14]、組織培養(yǎng)[15-16]、木材材性[17]、核酸提取和分子標記[18-19]、核型分析[20]、抗逆性[21]等，其中組織培養(yǎng)研究較多，但多側(cè)重于外植體消毒、快繁體系建立以及配方調(diào)試等方面[22-25]，而對于牛樟組培苗所需光照條件，如光周期、光照強度、光質(zhì)等方面的研究甚少。相關(guān)文獻報道，牛樟組培的培養(yǎng)光周期為10～14 h/d不等[22-23]，光照強度為1 000～2 500 lx[24,26]，跨度較大；此外，傳統(tǒng)組織培養(yǎng)室使用的照射光源為日常用熒光燈，存在耗電量大、散熱量大、光強分布均勻性差、壽命短等問題，也造成空調(diào)的負荷、耗電量增加，是試管苗生產(chǎn)成本過高的主要原因之一[27]。LED(light-emitting diode)即發(fā)光二極管，具有良好的光電特性，是一種高效、節(jié)能、可控性好的新型組培冷光源，其耗電量僅為白熾燈的1/8，熒光燈的1/2，且體積小，可以直接安裝在組培容器上或容器上方，節(jié)省空間，同時幾乎不發(fā)熱，可減少培養(yǎng)器皿的結(jié)露現(xiàn)象，在組培上的應用日漸廣泛[28-29]。光照作為光合作用的能量來源是影響植物生長的重要因素之一，光強、光質(zhì)、光周期等對植物生長發(fā)育和形態(tài)建成產(chǎn)生較大影響[30]，同時，鑒于LED 燈具在植物組織培養(yǎng)中的應用可降低大規(guī)模植物組培過程中的能耗，從而降低生產(chǎn)成本。【研究切入點】目前，對牛樟的研究并未針對不同生長部位、不同生長時期的光照需求進行詳細區(qū)分，亦無采用其他光源進行牛樟組培的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在前人基礎上，進一步研究不同光周期、光照強度等因素對牛樟組培苗不同生長階段的影響，同時研究采用能耗較低的新型LED燈作為光源的可行性，以期為牛樟組培苗的工廠標準化生產(chǎn)及降低種苗生產(chǎn)成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組培苗 供試材料為牛樟組培苗，由廣東省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心提供。選取處于壯苗階段、生長良好、長勢均一的牛樟組培苗作為接種材料。試驗采用牛樟組培苗的莖段做增殖培養(yǎng)，頂芽做壯苗或生根培養(yǎng)。

1.1.2 頂芽 截取組培苗從頂端開始往下帶有1個節(jié)的截段，高度約為1.5 cm。

1.1.3 莖段 將組培苗的頂芽、葉片及根部去除，以莖上的節(jié)為單位，截成單個莖段，每個莖段長度約為1 cm。

1.2 方法

1.2.1 光照設置

1) 熒光燈不同照射時長。采用2根普通28 W熒光燈作為光源，設置不同光照時間：6 h/d、9 h/d、12 h/d、15 h/d、18 h/d進行增殖和壯苗培養(yǎng)。

2) 不同光源設置。采用16 W紅、藍、白光混合燈珠，光譜波段為全光譜波段，其中全光譜峰值為430 nm、630 nm的LED燈作為試驗光源，以普通28 W熒光燈作為對照光源，同時設置2種光照強度，增殖、壯苗和生根培養(yǎng)試驗處理光照時長均為12 h/d(表1)。

表1 牛樟培養(yǎng)過程的不同光源設置及其光照強度

3) 延長LED光照時長。采用單根上述LED混合燈珠燈管作為試驗光源，以光照時間12 h/d作為對照，延長光照時間至18 h/d進行增殖和壯苗培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)基配方 參照文獻 [22,31]的方法配制培養(yǎng)基。

1) 增殖及壯苗培養(yǎng)基。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入6-BA 1.5 mg/L、IBA 0.1 mg/L，VC2 mg/L、生物素 0.24 mg/L、L-半胱氨酸 5 mg/L，蔗糖30 g/L、卡拉膠7.5 g/L，控制pH 5.8左右。

2) 生根培養(yǎng)基。以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入NAA 0.1 mg/L、IBA 1.0 mg/L，活性炭0.3 g/L，蔗糖25 g/L、卡拉膠7.5 g/L，控制pH 5.8左右。

1.2.3 接種方法 將頂芽垂直接入各處理頂芽培養(yǎng)基中，將莖段均勻平鋪于各處理莖段培養(yǎng)基中。每瓶培養(yǎng)基接入8個外植體，每處理接種5瓶，3次重復。接種約36 d后記錄莖段和頂芽的生長情況和生長指標，接種20 d后記錄頂芽生根的情況和生長指標。每處理隨機選取15個(每重復選取5個)外植體進行測量和記錄。

1.2.4 培養(yǎng)條件 在培養(yǎng)溫度(25±2)℃的環(huán)境下，試驗設置燈管為單個燈管的，試驗材料均擺放于正下方位置；試驗設置燈管為雙燈管的，試驗材料均擺放于2個燈管中部正對的下方位置。

1.2.5 移栽方法 不經(jīng)過煉苗，打開瓶蓋，用鑷子將苗夾出，并用清水洗去根部培養(yǎng)基，采用50穴穴盤盛裝基質(zhì)，將根部輕輕埋于基質(zhì)中。移栽過程中將組培苗置于清水中浸泡保濕，防止葉片失水萎蔫，移栽時以基質(zhì)蓋住根莖部為宜，防止種植過深。移栽基質(zhì)為進口泥炭土與珍珠巖的體積比為1∶1。移栽后馬上將穴盤置于定時噴霧環(huán)境中：噴霧時間間隔為20 min，每次8 s；霧化程度以牛樟葉片表面鋪有1層細水珠，但不滴水為準。

1.2.6 指標測定

1) 莖段。莖段萌芽率(已經(jīng)萌發(fā)新芽的莖段數(shù)/該處理總莖段數(shù)×100%)、莖段死亡率(已經(jīng)死亡的莖段數(shù)/總莖段數(shù)×100%)、萌芽數(shù)(單個莖段上萌發(fā)的芽的個數(shù))、萌芽高度、展葉數(shù)(指完全展開的葉片數(shù)，下同)、最大開展葉葉長和葉寬(葉片基部與葉柄連接處至葉尖的距離為葉長，葉片最大寬幅為葉寬，用直尺測量，下同)、愈傷組織生長量。

2) 頂芽。頂芽萌芽率(從莖節(jié)部位或基部萌發(fā)新芽的頂芽數(shù)/該處理總頂芽數(shù)×100%)、頂芽死亡率(死亡植頂芽數(shù)/該處理總頂芽數(shù)×100%，下同)、萌芽數(shù)(從頂芽莖節(jié)部位萌發(fā)的新芽數(shù)量，下同)、頂芽高度、展葉數(shù)、最大開展葉葉長和葉寬、愈傷組織生長量。

3) 生根培養(yǎng)頂芽。生根率(指生根的頂芽數(shù)/該處理總頂芽數(shù)×100%)、株高、最大開展葉葉長和葉寬、根數(shù)、根長、移栽成活率(指移栽后成活的生根苗數(shù)量/該處理中總生根苗數(shù)量)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行方差分析或T檢驗，Duncan’s法進行多重比較，方差非齊性時采用非參數(shù)的Kruskal-Wallis秩和檢驗，多重比較選擇“逐步降低”，用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光燈不同照射時長處理牛樟組培苗的生長

從表2可知，熒光燈不同照射時長對牛樟組培苗莖段的萌芽率、死亡率均無顯著影響，但對萌芽數(shù)、萌芽高度、展葉數(shù)、最大葉長和葉寬有顯著影響。光照為6～9 h/d時，萌芽數(shù)較多，且萌芽高度較高，說明較短的光照時長有利于牛樟的莖段萌芽以及拔高生長。然而在光照時長較短(6 h/d)時，莖段萌芽開展葉極少，且萌芽偏瘦弱；隨著光照時長的延長，展葉數(shù)呈先增后減再增再減趨勢，同時芽體逐漸變得健壯，在光照時長為15 h/d時，展葉數(shù)最多，但光照時長達18 h/d時，展葉數(shù)下降；此外，光照時長在6～12 h/d時，最大開展葉的葉長和葉寬并無顯著差異，當光照時長增至15～18 h/d時，最大開展葉葉長和葉寬出現(xiàn)顯著差異，并且在光照時長為18 h/d時，葉長和葉寬達最大。表明，不同光照時長對牛樟莖段萌發(fā)新芽的形態(tài)建成有重要影響。愈傷組織生成方面，在光照時長較短(6 h/d)時，莖段產(chǎn)生的愈傷組織非常少，隨著光照時長的增加，愈傷組織顏色加深數(shù)量增多。愈傷組織的生長量過大，將對外植體萌芽產(chǎn)生抑制作用，當光照時長為12 h/d和18 h/d時，愈傷組織較多，其萌芽數(shù)也較少；而在光照時長為6～9 h/d時，愈傷組織較少，萌芽數(shù)較多，芽較高。由于增殖培養(yǎng)時，需要截取莖段進行培養(yǎng)，而對葉片數(shù)量及大小要求低。因此，在以牛樟莖段作為外植體增殖，以雙熒光燈管作為光源時，宜選用9 h/d作為光照時長，此時萌芽率、萌芽數(shù)及萌芽高度均最大，且此時芽體比光照時長為6 h/d時健壯。

表2 不同熒光燈照射時長處理牛樟組培苗的莖段生長

從表3可知，熒光燈不同照射時長僅對牛樟組培苗頂芽的展葉數(shù)有顯著影響，在光照時長為6 h/d時展葉數(shù)最多，而對萌芽率、萌芽數(shù)、頂芽高度、最大開展葉葉長及葉寬均無顯著影響，但在光照時長為6 h/d時萌芽率、萌芽數(shù)及頂芽高度均最大，且此時的愈傷組織最少，芽體生長狀態(tài)良好。因此，在以雙熒光燈管作為光源，牛樟頂芽作為外植體進行壯苗培養(yǎng)時，宜選用6 h/d作為光照時長，萌生的側(cè)芽可以切下繼續(xù)進行增殖培養(yǎng)。

表3 不同熒光燈照射時長牛樟組培苗的頂芽生長

2.2 不同光源處理牛樟組培苗的生長

從表4可知，不同光源對牛樟莖段的萌芽率、芽的展葉數(shù)、最大開展葉葉長影響差異顯著(處理E的萌芽率、展葉數(shù)及最大葉長最大)，而對死亡率、萌芽數(shù)、萌芽高度、最大開展葉葉寬等無顯著影響，但處理E的莖段外植體死亡率最低(0%)，且葉寬最大。處理B的莖段萌發(fā)的芽體細長，無開展葉，處理D萌發(fā)的芽體較健壯，但部分芽畸形，表明不同的光源對牛樟莖段萌芽的形態(tài)建成有較大影響，全部采用LED燈管作為光源，芽體生長形態(tài)出現(xiàn)異常，而采用熒光燈和LED燈管搭配的處理E，則莖段萌發(fā)芽體狀態(tài)良好，且愈傷組織較少。與光照時長為9 h/d處理的莖段萌芽相比，處理E的萌芽高度雖然稍低，但莖段萌芽率更高、萌芽數(shù)及展葉數(shù)更多，且最大開展葉葉長和葉寬均更大，綜合考慮，優(yōu)選處理E作為牛樟莖段萌芽的光照條件。

表4 不同光源處理牛樟組培苗的莖段生長

從表5可知，不同光源對牛樟頂芽的萌芽率、死亡率、最大葉長和葉寬均無顯著影響，而對萌芽數(shù)、頂芽高度和展葉數(shù)有顯著影響，處理A的頂芽萌芽數(shù)及頂芽高度最高，但芽較瘦弱，而處理C的展葉數(shù)最多，因此處理A適用于將頂芽用于增殖，而如果將頂芽用于壯苗，則宜選用處理C，又由于1.2.1中試驗3)的結(jié)果表明，光照時長為6 h/d優(yōu)于處理C的12 h/d，因此以牛樟頂芽為外植體進行壯苗培養(yǎng)時，仍然選擇以雙熒光燈管作為光源，光照時長為6 h/d的處理。此外，頂芽在處理B下表現(xiàn)與莖段萌芽類似，植株多數(shù)無葉，而在處理D中表現(xiàn)正常，表明不同光強的LED燈作為光源對牛樟頂芽的生長狀態(tài)有不同的影響。

表5 不同光源處理牛樟組培苗的頂芽生長

從表6可知，不同光源對牛樟組培苗頂芽的生根率、株高、最大開展葉葉長和葉寬、以及移栽后的成活率有顯著影響，而對根數(shù)和根長無顯著影響。處理D的生根速度最快，接種后1 d生根率可達80%，但接種后20 d生根率則稍低，為94.67%；而處理C接種14 d時生根率僅次于處理D，為77.00%，但接種20 d后的生根率最高，達97.33%，同時處理C的株高及移栽成活率也最高，且最大開展葉葉長排位第2，僅次于處理E。因此，在進行牛樟頂芽生根培養(yǎng)時，宜選用處理C；而如果生產(chǎn)上需要進行快速生根，則可以采用處理D。

表6 不同光源處理牛樟的組培苗生根

2.3 延長LED光照時長牛樟組培苗生長

由于僅用1根LED燈處理時，光照強度較低(400～600 lx)，莖段萌芽及頂芽均出現(xiàn)無葉或少葉現(xiàn)象，嘗試將光照時長從12 h/d延長到18 h/d，試驗延長LED燈的光照時長是否能改善2種外植體的培養(yǎng)效果。試驗結(jié)果(表7)表明：延長光照時長對莖段的萌芽率無顯著影響，但對莖段死亡率、莖段萌芽數(shù)、萌芽高度、展葉數(shù)均有顯著影響，能有效降低莖段死亡率、增加莖段萌芽數(shù)以及萌芽高度，同時展葉數(shù)顯著增加，芽體形態(tài)趨向正常，且愈傷組織數(shù)量有所減少。對牛樟頂芽而言，延長光照時長對頂芽萌芽率、死亡率、萌芽數(shù)、最大開展葉葉寬均無顯著影響，而對頂芽高度、展葉數(shù)和最大開展葉葉長有顯著影響，光照時長增加，頂芽高度反而有所下降，但展葉數(shù)和最大葉葉長均有顯著增加，芽體頂部多數(shù)無葉的現(xiàn)象也得到改善，植株形態(tài)正常。因此，僅采用1根LED燈管作為光源時，可以通過延長光照時長，改善牛樟莖段和頂芽的生長狀況。

表7 延長LED燈照射時長處理牛樟組培苗莖段和組培苗頂芽生長

3 討論

目前，牛樟組培苗增殖主要有2種方式，一種是經(jīng)胚性愈傷誘導出體胚，再由體胚誘導植株再生[15-16]，另一種是由莖段直接萌發(fā)叢芽[31-33]。采用胚性愈傷，成功誘導植株再生的概率較低，為31.4%～58.9%，且過程較為繁瑣，而采用莖段萌芽的方法，較為簡單，一般分為叢生芽誘導、壯苗、生根等步驟即可出苗，效率較高，應用較廣，因此研究采用莖段作為外植體進行增殖。對牛樟組培苗進行切段時，植株除莖節(jié)外，剩余1節(jié)頂芽，由于頂芽與莖段是不同的生長部位，頂芽可用于繼續(xù)增殖，也可以用于壯苗、生根培養(yǎng)，因此也將頂芽對不同光照的反應納入試驗中。試驗結(jié)果表明，牛樟的不同外植體(莖段、頂芽)對同一光照條件的反應不同，同一外植體對不同的光照條件反應也不同，只有在適宜的條件下，增殖率才能達到最大。表明：在生產(chǎn)上應改變同一物種在組培過程中相同的光照條件，在完善配方調(diào)試后，應根據(jù)不同的外植體及不同的培育階段選擇適宜的光照條件，在提高生產(chǎn)效率的同時降低能耗。

光照是植物組培苗生長不可缺少的條件，光照強度和光周期將影響植物的光合作用和光形態(tài)建成[30]。對牛樟、香樟、猴樟等樟科植物的光照環(huán)境研究表明，強光下苗木將生物量相對多地分配到地下根系生長，弱光條件下則將生物量相對多地分配到地上部分，發(fā)展比葉重較低但單葉面積較大的葉子[34-35]。但該試驗的結(jié)果顯示，牛樟組培苗的莖段萌芽和頂芽在較弱光照及較短光照時長時，莖上部分的葉片很少或無，反而在光照增強和加強光照時長時葉片數(shù)量增加，葉片面積增大，與前述結(jié)論相反，可能是由于牛樟組培苗的外植體的光照為非自然光，缺乏激發(fā)自身調(diào)節(jié)的光照成分，且處于異養(yǎng)狀態(tài)，營養(yǎng)供應充足時外植體對外界不良環(huán)境做出的反應不夠及時所致。

光質(zhì)與植物體內(nèi)的光合色素、光敏色素作用，進而影響植物的光合作用及形態(tài)建成[36]，不同的光質(zhì)及光質(zhì)比例對植物生長有重大影響[37-39]。大量研究表明，紅光和藍光是植物生長最重要的2種光譜，紅光影響植物的葉片擴展、干物質(zhì)累積和莖的伸長，藍光影響植株的葉片和莖的生長[37]，對于不同物種，由于藍光/紅光受體和光敏色素的相互協(xié)同作用不同，從而紅藍光對植株生長的影響也不同[40]。該研究僅采用16 W紅、藍、白光混合燈珠的LED燈管進行試驗，發(fā)現(xiàn)增殖和壯苗時僅采用該種LED燈管進行光照，效果不佳，但將LED燈和熒光燈結(jié)合使用，能對莖段誘導叢芽起到良好效果；同時采用2根LED燈管照射，可以在短時間內(nèi)提高牛樟組培苗的生根效率，為生產(chǎn)上調(diào)節(jié)出苗時間提供參考；但要求生根率最高時，最好采用熒光燈，可根據(jù)不同生產(chǎn)需要選用光照條件。在生產(chǎn)上加入LED燈照射，可在一定程度上減少電量消耗，同時減少熒光燈照射時所帶來的熱量，降低空調(diào)負荷。但該試驗未對其中紅、藍光所產(chǎn)生的不同影響進行詳細區(qū)分，未來可采用不同光質(zhì)的可調(diào)控LED燈管進一步開展試驗。

牛樟組培苗移栽后葉片非常容易失水，經(jīng)常需要加蓋薄膜保濕，然而在炎熱夏季，環(huán)境溫度達33℃以上時，薄膜內(nèi)部溫度可達40℃以上，此時牛樟組培苗根莖部位非常容易腐爛死亡，成活率不到10%，因而該試驗采用露天定時噴霧的移栽方式，既有利于散熱，也有利于葉片保濕，能大大提高成活率。移栽結(jié)果表明，不同的光照處理對牛樟的移栽成活率有顯著影響，可能是由于不同的光處理影響組培苗的形態(tài)建成和生理特性，如葉片的氣孔、葉綠素、角質(zhì)化程度[40]，根系的生長、盤結(jié)力和根系活力等[41]導致。

4 結(jié)論

綜上所述，以牛樟莖段作為外植體時，宜采用1根熒光燈+1根LED燈的組合，光照時長為12 h/d；以牛樟頂芽作為外植體時，宜采用1根熒光燈、光照時長為12 h/d的光照方案，壯苗培養(yǎng)則宜采用2根熒光燈、光照時長為6 h/d的光照方案；進行牛樟生根培養(yǎng)時，若要求生根率最大，宜采用1根熒光燈、光照時長為12 h/d的光照方案；若要求生根速度較快時，則可以采用2根LED燈管、光照時長為12 h/d的光照方案。通過增加LED燈的光照強度或延長光照時長，均有利于牛樟莖段和頂芽的生長以及萌芽的形態(tài)建成。