小鼠肝細粒棘球蚴和多房棘球蚴病不同時期病灶周圍組織纖維化對比

邢稚坤，王二強，廖 原，高風(fēng)亦，趙雪源，譚小武，俞曉凡，吳向未

棘球蚴病是一種世界范圍的人獸共患病，以細粒棘球蚴絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg)、多房棘球蚴絳蟲(Echinococcusmultilocularis，Em)幼蟲引起的疾病最為常見[1]。棘球蚴病可發(fā)生在肝、肺、腦等部位發(fā)生，肝臟是其最常見的好發(fā)部位[2-4]。棘球蚴寄生于肝臟后會引起周圍組織炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生、纖維化、鈣化等一系列病理生理變化，其中纖維化會伴隨整個寄生過程[5]。由Eg引起的肝囊型包蟲病(Cysticechinococcosis，CE)和由Em引起的肝泡型包蟲病(Alveolarechinococcosis，AE)周圍組織纖維化情況有所不同，造成兩種棘球蚴的治療方式不同。前期研究發(fā)現(xiàn)包蟲周圍組織纖維化主要由I型膠原(CollagenⅠ，COL1)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ，COL3)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，COL4)構(gòu)成，其中COL1、COL3的含量較高[6-7]。本實驗通過HE、masson、免疫組化染色，對比小鼠不同時間段兩種包蟲纖維化進程的區(qū)別，進一步了解多房棘球蚴體內(nèi)生長發(fā)育過程，從而尋找更好的診療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材

1.1.1 主要耗材 本實驗所用一抗(COL1：ab34710；COL3：ab184993；α-SMA：ab124964；TGF-β1：ab92486)、Masson染色試劑盒來自abcam公司，HE染色試劑盒來自生工生物工程(上海)股份有限公司，免疫組化二步法試劑盒(PV-6001)來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1640培養(yǎng)基來自gibco，青鏈霉素混合液來自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清來自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.2 主要儀器 Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2245)，蔡司顯微鏡(Axio Imager 2)，賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機，賽默飛公司二氧化碳培養(yǎng)箱(Heracell 240i)，Eppendorf公司移液器。

1.1.3 實驗動物 來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，1月齡雌鼠90只。

1.2 原頭節(jié)的提取

1.2.1 細粒棘球蚴 屠宰場購買患病羊肝(本地牲畜屠宰場，現(xiàn)場無菌封裝)，從中提取細粒棘球蚴原頭節(jié)，用含有雙抗的PBS清洗數(shù)遍后，放入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中待用。用伊紅染色劑鑒定原頭節(jié)活性，活性大于90%可用。

1.2.2 多房棘球蚴 新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心購SPF級長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)，腹腔種植多房棘球蚴原頭節(jié)，6月后開腹提取腹腔多房棘球蚴組織，經(jīng)過研磨、過濾、清洗提取出多房棘球蚴原頭節(jié)。用伊紅染色劑鑒定原頭節(jié)活性，活性大于90%可用。

1.3 動物模型的建立 選用健康雌性1月齡的C57BL/6小鼠90只，分為細粒棘球蚴組30只、多房棘球蚴組30只和對照組30只，細粒棘球蚴組、多房棘球蚴組分別進行肝被膜下注射5 000個相應(yīng)原頭節(jié)，對照組肝被膜下注射等量的RPMI-1640培養(yǎng)基[8]。造模完成后分別于30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d 收取小鼠肝臟標本。

1.4 標本的處理 小鼠肝臟取得后使用PBS緩沖液沖洗3次，放入4%中性甲醛中浸泡48 h，全自動脫水機脫水處理，石蠟包埋，制成3 μm石蠟切片。

1.5 染色 HE染色：脫蠟至水，中性蘇木素染色6 min，清水沖洗10 min，鹽酸酒精分化，伊紅染色1 min。免疫組織化學(xué)染色：抗原修復(fù)采用pH6枸櫞酸高壓修復(fù)法，染色采用EnViSion二步染色。

1.6 統(tǒng)計分析 本實驗使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料使用卡方檢驗進行比較，理論頻數(shù)小于1的分組使用Fisher’s確切概率法，計量資料符合正態(tài)分布的使用t檢驗進行比較，如果不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H&E染色觀察CE、AE發(fā)育過程 動物模型兩種包蟲不同時期的HE染色可觀察到，細粒棘球蚴組30 d未形成囊腫，存在變形增大的原頭節(jié)，以及大量炎癥細胞浸潤，30～60 d形成囊腫組織，可見完整的內(nèi)囊壁，內(nèi)囊周圍有較厚的炎癥帶，60～120 d內(nèi)囊逐漸增厚，內(nèi)囊周圍炎癥帶逐漸減少至消失，外囊逐漸形成，120～180 d內(nèi)囊壁、外囊壁逐漸增厚，囊腫對周圍組織擠壓明顯。

多房棘球蚴組30 d頭節(jié)注射部位可見大量炎細胞浸潤，肉芽組織增生，未見囊腫形成，未見完整的原頭節(jié)。囊腫形成在30～60 d，90 d后可觀察到囊腫向周圍組織浸潤現(xiàn)象，囊腫無固定形態(tài)，120 d后囊腫繼續(xù)增長，出現(xiàn)玻璃樣變纖維組織，180 d組可見大面積玻璃樣變纖維組織，其中包含大量大小不同的囊腫。AE生長過程中內(nèi)囊壁增厚不明顯且對周圍組織的浸潤、侵襲始終存在。

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組，*標注為包蟲囊內(nèi)(×200)，病灶周圍可見大量炎癥反應(yīng)，包括巨噬細胞、淋巴細胞、上皮樣細胞等圖1 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本HE染色Fig.1 HE staining of mice liver specimens of CE and AE at different stages

2.2 Masson染色觀察CE、AE膠原纖維分布情況 Masson染色細粒棘球蚴組30 d可觀察到病灶周圍炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域內(nèi)分泌大量膠原纖維蛋白，60 d可見膠原纖維蛋白在內(nèi)囊外側(cè)聚集，90 d可見炎癥及肉芽組織區(qū)域面積減少，在內(nèi)囊外側(cè)沉積的纖維蛋白形成纖維外囊，120～150 d可見炎癥及肉芽腫區(qū)域減退至消失，膠原蛋白纖維由彌漫分布逐漸形成連續(xù)致密的纖維外囊，180 d纖維外囊進一步致密增厚。

多房棘球蚴組30 d見病灶周圍炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域內(nèi)分泌大量膠原纖維蛋白類似于細粒棘球蚴組，60～90 d可見纖維蛋白在內(nèi)囊外側(cè)彌漫性分布無明顯聚集現(xiàn)象，90～150 d膠原纖維蛋白仍呈彌漫性分布，有聚集形成外囊的現(xiàn)象但是相較細粒棘球蚴組，其外囊較為疏松，未見形成連續(xù)致密的纖維外囊，在多房棘球蚴病灶中形成的玻璃樣變纖維化組織中可見大面積膠原蛋白分布，如圖2L。

2.3 免疫組化染色觀察COL1、COL3分布情況 在細粒棘球蚴組COL1、COL3免疫組化染色，觀察到兩種膠原蛋白的分布符合Masson染色膠原纖維的分布情況， COL1、COL3在包蟲周圍炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域分布高于其他區(qū)域，且兩種膠原蛋白的分布在該區(qū)域中由彌散性逐漸聚集成完整連續(xù)的纖維外囊，見圖3和圖4。

多房棘球蚴組COL1、COL3在包蟲周圍炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域分布高于其他區(qū)域，其中相較于同一時期細粒棘球蚴組COL1在病灶周圍的表達相對較低。病灶周圍COL3高表達，但彌散性分布無法聚集成完整纖維外囊。

對小鼠肝組織COL1、COL3的表達強度進行分析，對照組小鼠肝細胞COL1、COL3呈弱陽性(+)表達，因此統(tǒng)計陽性(++)和強陽性(+++)的表達率如表1，使用Fisher’s精確檢驗COL1的表達，CE組對比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對比NC組(P=0.000<0.05)，COL3的表達CE組對比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對比NC組(P=0.000<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。為觀察COL1、COL3表達強度與天數(shù)之間的關(guān)系，繪制散點圖及擬合線，并進行相關(guān)性分析(表2、圖5)，CE組COL1的表達強度與時間呈負相關(guān)(P=0.000<0.05)，CE組COL3的表達強度與時間呈負相關(guān)(P=0.000<0.05)，AE組COL1的表達強度與時間無明顯相關(guān)性(P=0.059>0.05)，AE組COL3的表達強度與時間無明顯相關(guān)性(P=0.848>0.05)，隨著細粒棘球蚴完整纖維外囊的形成，細粒棘球蚴病灶周圍的COL1、COL3表達降低，多房棘球蚴病灶周圍COL1、COL3表達隨時間變化不明顯。對比COL1、COL3的表達時發(fā)現(xiàn)CE中兩種膠原蛋白的比值相較于AE組有差異，使用ImageJ軟件計算兩種膠原蛋白的表達面積，并計算出不同時間段COL1/COL3表達面積比值進行比較，CE組高于AE組，如圖6使用秩和檢驗將CE組全部標本與AE組全部標本的COL1/COL3進行對比(Z=-3.23，P=1.2×10-3<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組, 箭頭標注為膠原纖維區(qū)域(藍色)，*標注為包蟲囊內(nèi)(×200)圖2 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本Masson染色Fig.2 Masson staining of mice liver specimens of CE and AE at different stages

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組，箭頭標注為COL1表達區(qū)域(褐色)，*標注為包蟲囊內(nèi)(×200)圖3 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本COL1 IHC染色Fig.3 Col1 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組,箭頭標注為COL3表達區(qū)域(褐色),“*”標注為包蟲囊內(nèi)(×200)圖4 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本COL3 IHC染色Fig.4 Col3 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

表1 小鼠肝組織中COL1和COL3的表達Tab.1 Expression of COL1 and COL3 in mouse liver tissue

圖5 CE、AE標本COL1、COL3表達強度與時間的的散點圖，并繪制擬合線Fig.5 Scatter plot of COL1 and COL3 expression intensity and time in CE and AE specimens, and draw the fitting line

表2 兩種棘球蚴病病灶周圍COL1、COL3表達強度與造模時間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between the expression intensity of COL1 and COL3 around the lesions of the two hydatid diseases and the days of modeling

①P<0.05圖6 CE組、AE組全部樣本COL1/COL3值柱狀圖Fig.6 Col1/Col3 histogram of all samples in CE group and AE group

2.4 免疫組化染色觀察α-SMA、TGF-β1表達情況 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫組化染色可見，對照組中僅在血管壁中表達，實驗組主要表達在炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域。隨著細粒棘球蚴組連續(xù)致密的纖維外囊形成，α-SMA表達逐漸減少，直至180 d 組可見其囊周表達基本消失。多房棘球蚴組炎癥浸潤及肉芽組織增生區(qū)域始終存在，α-SMA在整個試驗周期中均有較高的囊周表達，見圖7。

TGF-β1免疫組化可見，對照組肝細胞中有TGF-β1表達，高表達于囊周組織，在細粒棘球蚴組中可見隨著致密纖維外囊的形成TGF-β1的表達逐漸減少，多房棘球蚴組囊周持續(xù)有TGF-β1高表達，見圖8。

α-SMA、TGF-β1在病灶周圍表達強度情況如表3，使用Fisher’s精確檢驗α-SMA的表達CE組對比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對比NC組(P=0.000<0.05)；TGF-β1的表達CE組對比NC組(P=0.000<0.05)，AE組對比NC組(P=0.000<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。為觀察α-SMA、TGF-β1表達強度與天數(shù)之間的關(guān)系，繪制散點圖及擬合線，并進行相關(guān)性分析如表4、圖9，CE組α-SMA的表達強度與時間呈負相關(guān)(P=0.000<0.05)，CE組TGF-β1的表達強度與時間呈負相關(guān)(P=0.000<0.05)，AE組α-SMA的表達強度與時間無明顯相關(guān)性(P=0.573>0.05)，AE組TGF-β1的表達強度與時間無明顯相關(guān)性(P=0.437>0.05)隨著細粒棘球蚴完整纖維外囊的形成，細粒棘球蚴周圍的α-SMA、TGF-β1表達降低，多房棘球蚴病灶周圍α-SMA、TGF-β1表達隨時間變化不明顯。

表3 小鼠肝組織中 鼠肝組織中和TGF-織中的表達Tab.3 Expression of α-SMA and TGF-β1 in mouse liver tissue

α-SMA IHC染色；A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組, 箭頭標注為α-SMA表達區(qū)域(褐色),“*”標注為包蟲囊內(nèi)(×200)圖7 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本α-SMA IHC染色Fig.7 α-SMA IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

A-F為CE組，G-L為AE組，M-R為對照組,箭頭標注為TGF-β1表達區(qū)域(褐色),“*”標注為包蟲囊內(nèi)(×200)圖8 不同時期小鼠肝臟CE、AE標本TGF-β1 IHC染色Fig.8 TGF-β1 IHC staining of CE and AE liver specimens in different periods

圖9 CE、AE標本α-SMA、TGF-β1表達強度與時間的的散點圖及其擬合線Fig.9 Scatter plot ofα-SMA and TGF-β1 expression intensity and time in CE and AE specimens, and draw the fitting line

表4 兩種包蟲病病灶周圍α-SMA、TGF-β1表達強度與造模天數(shù)間的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between the expression intensity of α-SMA and TGF-β1 around the lesions of the two hydatid diseases and the days of modeling

3 討 論

CE、AE兩種疾病均為慢性占位性病變，但是在生長模式、治療方案上有較大的差異。CE因為其與周圍組織有明確的界線，轉(zhuǎn)移病灶較少，手術(shù)治療后可治愈[9-10]。AE雖然從組織病理學(xué)上看是一種良性疾病，但它表現(xiàn)出惡性疾病的特點，生長過程中對周圍組織具有破壞性、侵犯鄰近器官和遠處播散的特點[11]，因此被稱為“蟲癌”。目前早期根治性手術(shù)可以提高患者生存質(zhì)量、生存周期[12]。兩種疾病引起周圍組織纖維化模式不同是造成以上差異的重要因素。

TGF-β通路是纖維化過程中重要的信號通路，其中TGF-β1被認為是TGF-β通路的主要啟動因子之一[13]。TGF-β1在組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、星狀細胞的活化及細胞外基質(zhì)分泌等過程中起主要調(diào)節(jié)作用[14]。在肝臟中TGF-β1是提高肝纖維化最有效的因子之一，可以激活肝星狀細胞，同時可以提高肉芽組織中成纖維細胞α-SMA mRNA的表達[15]。肝星狀細胞在纖維化過程中有重要作用，在炎癥及損傷等因素的過程中，肝星狀細胞分泌多余的細胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟中導(dǎo)致纖維化[16]。肝星狀細胞在包蟲的持續(xù)刺激下激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞表達α-SMA[17]，因此在肝臟中α-SMA通常作為肝星狀細胞活化的標志物，反映了星狀細胞活化和由疾病引起的持續(xù)壞死性炎癥的進展情況[18]。對細粒棘球蚴侵入肝臟，會引起病灶周圍炎癥反應(yīng)并形成肉芽腫[19]，肝星狀細胞被激活，分泌大量細胞外基質(zhì)及細胞因子導(dǎo)致ECM過度沉積即周圍肝組織纖維化形成完整致密的纖維外膜。纖維外膜的形成能在一定程度上限制棘球蚴的生長發(fā)育，與周圍肝組織形成明確的界線；在完整的纖維外囊形成過程中，囊周的炎癥及肉芽組織增生反應(yīng)減弱直至消失，α-SMA、TGF-β1在囊周的表達也逐漸減弱，纖維化進程也逐漸減緩；可以說完整的纖維外囊可以減輕寄生蟲與宿主間的抗原抗體反應(yīng)以及纖維化反應(yīng)。對于多房棘球蚴組，周圍肝組織彌漫性纖維化，無法形成完整致密的纖維外膜，囊周α-SMA、TGF-β持續(xù)高表達，可以認為囊周持續(xù)有活躍的纖維化反應(yīng)，彌漫性纖維化無法限制棘球蚴的生長發(fā)育，可以造成大面積肝組織纖維化、玻璃樣變纖維化，影響肝功能。

實驗中發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴相較于細粒棘球蚴病灶周圍I型膠原的表達較低。由于I型膠原和III型膠原結(jié)構(gòu)不同而具有不同的性質(zhì)。I型膠原由機械強度較高而順應(yīng)性較差的原纖維組成，而III型膠原纖維彈性好，順應(yīng)性較好，機械強度較低[20]。研究表明I/III型膠原比例對各種組織的功能完整性至關(guān)重要，增加I型膠原的降解或增加III型膠原的沉積可能有助于對抗組織間質(zhì)基質(zhì)的高強度低順應(yīng)性[21]。在擴張性心肌病中I/III型膠原比例增高心臟的強度增大，組織順應(yīng)性下降[22-23]，III型分泌增多導(dǎo)致I/III型膠原比例降低，使得結(jié)締組織機械強度降低[24]。由圖3、4、6可見多房棘球蚴組囊周I/III型膠原比例小于細粒棘球蚴組，這也可能是細粒棘球蚴囊周產(chǎn)生連續(xù)致密纖維外囊而多房棘球蚴較少產(chǎn)生完整纖維外囊的原因之一。如果使多房棘球蚴囊周形成連續(xù)致密囊壁，將在一定程度上限制多房棘球蚴的生長、轉(zhuǎn)移，減輕宿主炎癥反應(yīng)，同時有助于多房棘球蚴的手術(shù)治療。如何使多房棘球蚴囊周形成連續(xù)致密的纖維外膜，有待進一步研究。

利益沖突：無

引用本文格式：邢稚坤，王二強，廖原，等.小鼠肝細粒棘球蚴和多房棘球蚴病不同時期病灶周圍組織纖維化對比[J].中國人獸共患病學(xué)報，2021，37(11)：1008-1016. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.140