痤瘡丙酸桿菌生物膜形成與抗菌藥物耐藥的相關(guān)性分析

馬 英， 劉 曄， 蔣 敏， 范逍遙， 張 臻， 韓 凌， 吳 旸， 賀軼軒

痤瘡是毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)[1]，其中，痤瘡丙酸桿菌（Cutibacterium acnes）的大量繁殖與痤瘡發(fā)生密切相關(guān)[2]。系統(tǒng)或局部應(yīng)用抗菌藥物抑制痤瘡丙酸桿菌是治療痤瘡的重要手段。然而痤瘡丙酸桿菌對抗生素的耐藥率正在不斷增加，尤以對大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類的耐藥率最高[3]。以往的研究普遍認為痤瘡丙酸桿菌的耐藥性主要是由于染色體變異。例如對紅霉素和克林霉素的交叉耐藥與編碼23S rRNA 的基因發(fā)生點突變有關(guān)[4-5]。

近年來，關(guān)于細菌生物膜形成導(dǎo)致抗菌藥物耐藥的研究越來越多。體外研究發(fā)現(xiàn)，生物膜內(nèi)細菌對抗菌藥物的抵抗性是浮游菌的1 000倍[6]。有學(xué)者認為痤瘡丙酸桿菌生物膜能夠滲透到皮脂中，起到黏合劑的作用，導(dǎo)致角質(zhì)細胞相互聚集和微粉刺形成[7]。最近的研究在對不同系統(tǒng)型痤瘡丙酸桿菌菌株體外生物膜形成能力的比較分析中發(fā)現(xiàn)，IA1型菌株顯示出比其他系統(tǒng)型高2～8倍的生物膜形成能力，而同時IA1型菌株又與中重度痤瘡有很強的關(guān)聯(lián)[8]。本研究通過體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌臨床株的生物膜，分析痤瘡丙酸桿菌耐藥性與生物膜形成的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2019年1—6月自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院痤瘡患者皮損處收集分離痤瘡丙酸桿菌44株。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂平板購自廣州迪景微生物科技有限公司，布氏瓊脂肉湯、腦心浸液培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、葡萄糖、酵母提取物購自英國OXOID公司，Live/Dead染液購自美國Invitrogen公司，CellTiter-BlueTM染液購自美國Promega公司，96孔細胞培養(yǎng)板（3599）、96孔酶標板購自美國Corning公司，玻璃底熒光皿（FD35-100）購自美國WPI公司，紫外分光光度計購自德國Eppendorf公司，酶標儀購自德國Biometra GmbH公司，激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 對痤瘡患者面部粉刺、丘疹和膿皰用75%乙醇消毒后，用粉刺針采集痤瘡丙酸桿菌菌株。菌株接種于添加了去纖維蛋白的綿羊血和維生素K的布氏培養(yǎng)基，并置于厭氧箱（5%CO2， 10% H2， 85% N2）內(nèi)培養(yǎng) 72 h。

1.2.2 細菌鑒定 經(jīng)過兩個純化周期后，利用API-20A系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）對培養(yǎng)的微生物進行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗 按照瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，測定克林霉素、紅霉素、莫匹羅星、夫西地酸、四環(huán)素的MIC。每種藥物分別采用對倍稀釋法制備成從128 mg/L到0.06 mg/L 12種不同濃度的瓊脂板。使用多點接種器將每1 μL含有105CFU的痤瘡丙酸桿菌標準菌液接種于瓊脂表面，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測定MIC。結(jié)果根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)化會（CLSI）2018年版的標準判讀[9]。

1.2.4 培養(yǎng)基 對實驗室容易獲得和配置的4種培養(yǎng)基進行了比較，包括腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、BHI補充培養(yǎng)基（添加了葡萄糖和酵母提取物的BHI培養(yǎng)基）、TSB補充培養(yǎng)基（添加了葡萄糖和酵母提取物的TSB培養(yǎng)基）。在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h和120 h后，用結(jié)晶紫染色法測定生物膜的生物量，并用刃天青染色評估生物膜內(nèi)細胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他三種培養(yǎng)基相比，BHI補充培養(yǎng)基中痤瘡丙酸桿菌的生物膜生物量和細胞活力均顯著提高，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察時，痤瘡丙酸桿菌表現(xiàn)出更強的黏附力和更有序的生物膜結(jié)構(gòu)。BHI補充培養(yǎng)基是體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜的理想培養(yǎng)基，其配方如下：將37 g BHI干粉和5 g酵母抽提物溶解在1 L去離子水中，并添加葡萄糖以制備1%葡萄糖溶液（pH 7.0）。

1.2.5 細菌培養(yǎng) 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI補充培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩厭氧培養(yǎng)120 h。用無菌離心管收集菌體，離心后棄上清液。用BHI補充培養(yǎng)基重懸菌體，使用紫外分光光度計調(diào)整至D600nm=1.0，再用BHI補充培養(yǎng)基以1∶100稀釋，加入96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），37℃厭氧培養(yǎng)120 h。當(dāng)培養(yǎng)至96 h、120 h時，分別進行以下操作：棄菌液，加入PBS（200 μL/孔）洗去未黏附細菌，重復(fù)洗3次。

1.2.6 生物膜半定量檢測 向上述處理好的96孔板內(nèi)加入99%甲醇固定15 min，棄去液體后室溫干燥。再加入1%結(jié)晶紫染色8 min，自來水沖洗至流水無色，室溫干燥。10%乙酸溶液溶解生物膜，室溫干燥后使用紫外分光光度計測定D570nm。不接種菌株的BHI補充培養(yǎng)基作為陰性對照（Dc）。

1.2.7 生物膜內(nèi)活菌數(shù)量檢測 在培養(yǎng)處理好的96孔板，每孔加入100 μL生理鹽水，反復(fù)吹打使生物膜內(nèi)細菌完全重懸于生理鹽水中。將每孔內(nèi)重懸后的菌液分別轉(zhuǎn)移至白色96孔酶標板內(nèi)，并向每孔加入20 μL CellTiter-BlueTM試劑，300 r/min搖1 min，37℃厭氧培養(yǎng)1 h，酶標儀記錄熒光。CellTiter-BlueTM試劑，即溶解于緩沖溶液中的高純度的刃天青。有活性的細胞可將深藍色的氧化型染料（刃天青）轉(zhuǎn)化為紅色的還原型染料（試鹵靈），并產(chǎn)生熒光信號。

1.2.8 生物膜結(jié)構(gòu)觀察 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI補充培養(yǎng)基，使用紫外分光光度計調(diào)整至D600nm=1.0，再用BHI補充培養(yǎng)基以1∶10稀釋，稀釋后的菌液再加入至玻璃底熒光皿（2 mL/皿），37℃厭氧培養(yǎng)至120 h。棄上清液，生理鹽水輕柔洗3次，加入600 μL Live/Dead染液，室溫放置20 min后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個玻璃底熒光皿至少選擇5處進行觀察（4個角落和中央）。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，獨立樣本t檢驗比較不同菌株D570nm、560EM/590EX熒光值之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 6軟件繪圖，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗

44株痤瘡丙酸桿菌對莫匹羅星的耐藥率為100%。對紅霉素的耐藥率為47.7%，對克林霉素的耐藥率為56.8%。見表1。18株痤瘡丙酸桿菌對克林霉素和紅霉素表現(xiàn)出交叉耐藥。將痤瘡丙酸桿菌分為敏感株、克林霉素-紅霉素雙耐藥株、紅霉素耐藥株和克林霉素耐藥株，研究生物膜形成與耐藥的關(guān)系。

表1 痤瘡丙酸桿菌對抗菌藥物的敏感性和耐藥性Table 1 Susceptibility of Cutibacterium acnes strains to antimicrobial agents

2.2 生物膜半定量檢測

培養(yǎng)至96 h和120 h時，結(jié)晶紫染色測量不同耐藥性菌株的D570nm。Dc為陰性對照孔的D570nm，當(dāng)D＞Dc則判定為有生物膜形成。所有菌株D570nm均大于Dc，提示有生物膜形成。培養(yǎng)至96 h和120 h時，全部耐藥菌株D570nm均大于敏感菌株D570nm，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）。見表2。該結(jié)果說明，耐藥株形成的生物膜生物量明顯高于敏感株。

表2 培養(yǎng)至96 h和120 h時不同耐藥性菌株生物膜生物量Table 2 Cutibacterium acnes biofilm biomass after cultivation for 96 h and 120 h

2.3 生物膜內(nèi)活菌數(shù)量檢測

培養(yǎng)至96 h和120 h時，刃天青染色測量不同耐藥性菌株的560Ex/590Em，培養(yǎng)至96 h和120 h時，全部耐藥菌株熒光值均大于敏感菌株熒光值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。該結(jié)果說明，耐藥株所形成的生物膜內(nèi)活菌數(shù)量明顯高于敏感株。

表3 培養(yǎng)至96 h和120 h時不同耐藥性菌株生物膜內(nèi)活菌數(shù)量Table 3 Live bacteria in C. acnes biofilm after cultivation for 96 h and 120 h

2.4 生物膜形態(tài)的觀察

與結(jié)晶紫染色和刃天青染色結(jié)果一致，培養(yǎng)至120 h時使用激光共聚焦顯微鏡觀察克林霉素-紅霉素雙重耐藥株與敏感株生物膜形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯差異?？肆置顾?紅霉素雙重耐藥株形成的生物膜能夠牢固地附著于玻璃底熒光皿底部，經(jīng)PBS水洗后仍未與玻璃底熒光皿底部脫離。在激光共聚焦顯微鏡下可見玻璃底熒光皿底部均勻附著一層膜狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部痤瘡丙酸桿菌較為整齊地排列成鏈條狀（圖1A、C）。而抗菌藥物敏感的痤瘡丙酸桿菌形成的生物膜附著不牢固，經(jīng)過PBS水洗后大部分與玻璃底熒光皿底部脫離，分散成塊狀漂浮。在激光共聚焦顯微鏡下雖可以看到生物膜內(nèi)痤瘡丙酸桿菌相互聚集，但排列雜亂，無規(guī)律結(jié)構(gòu)（圖1B、D）。

圖1 培養(yǎng)至120 h時激光共聚焦顯微鏡觀察不同耐藥性菌株生物膜形態(tài)Figure 1 The morphological features of Cutibacterium acnes biofilm after cultivation for 120 hours observed under a confocal laser scanning microscope

3 討論

痤瘡是一種好發(fā)于青春期的毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病。痤瘡的臨床特征包括粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫，愈后可留有不同程度的瘢痕，給患者身心健康帶來很大影響。痤瘡的發(fā)病機制仍未完全闡明，目前認為發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素包括胰島素、胰島素樣生長因子-1、雄激素等激素分泌增加、皮脂腺過度分泌、毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化異常以及炎癥和免疫反應(yīng)[10]。其中，痤瘡丙酸桿菌的大量繁殖與痤瘡發(fā)生密切相關(guān)[2]。

幾十年來，抗菌藥物一直是治療痤瘡的關(guān)鍵手段。四環(huán)素類、甲氧芐啶-磺胺甲唑、甲氧芐啶、大環(huán)內(nèi)酯類、阿莫西林和頭孢氨芐的療效已得到證實[11]。然而，痤瘡丙酸桿菌的耐藥率正在不斷上升。其中，痤瘡丙酸桿菌對紅霉素和克林霉素的耐藥率高達50%[12]。一些痤瘡丙酸桿菌甚至表現(xiàn)出對多種抗菌藥物的耐藥性。一項體外實驗表明，痤瘡丙酸桿菌對硫酸新霉素、克林霉素、紅霉素的耐藥率分別為11.7%、33.4%、49.3%，對多黏菌素B和莫匹羅星則表現(xiàn)出了完全耐藥性[13]。

細菌生物膜的存在可能在對抗菌藥物耐藥中起著關(guān)鍵作用。生物膜有三個關(guān)鍵的組成部分：細菌細胞、供細菌附著的平面，以及細胞外的多糖蛋白復(fù)合物。生物膜的耐藥機制包括細菌分泌的多糖蛋白復(fù)合物阻礙了抗菌藥物的滲透，生物膜深部的休眠細胞的生長速率和代謝率低，特定耐藥基因的表達，通過自誘導(dǎo)分子從周圍環(huán)境整合信息等[14-16]。Jahns等[17]發(fā)現(xiàn)痤瘡患者皮損中痤瘡丙酸桿菌生物膜的檢出率（37%）明顯高于良性色素痣患者（13%）。Kravvas等[18]發(fā)現(xiàn)，生物膜與痤瘡、濕疹、化膿性汗腺炎、甲真菌病、粟粒疹和膿皰病的發(fā)病有關(guān)。然而，目前尚無體外研究報道痤瘡丙酸桿菌生物膜形成與抗菌藥物耐藥的關(guān)系。

本研究比較了不同痤瘡丙酸桿菌菌株的生物膜形成能力，并分析了生物膜形成與抗菌藥物耐藥性的關(guān)系。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，BHI補充培養(yǎng)基是體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜的理想培養(yǎng)基。使用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜生物量，刃天青染色法檢測生物膜內(nèi)的活菌數(shù)量，使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)96 h和120 h后，耐藥株的生物膜生物量（D570nm）和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)量（560Ex/590Em）顯著高于敏感株。此外，耐藥株的生物膜經(jīng)過洗滌后，仍能牢固附著在玻璃底熒光皿底部，形成均勻的膜狀結(jié)構(gòu)，并且生物膜內(nèi)部痤瘡丙酸桿菌整齊地排列為鏈條狀。而敏感株的生物膜經(jīng)過洗滌，從玻璃底熒光皿底部脫落，呈分散狀漂浮，其內(nèi)部的痤瘡丙酸桿菌雖然相互聚集，但排列雜亂無章。

本研究結(jié)果表明，痤瘡丙酸桿菌生物膜的形成與其耐藥有關(guān)。此外，與其他耐藥菌株相比，克林霉素-紅霉素雙重耐藥菌株所形成的生物膜內(nèi)部活菌數(shù)量更多，這表明生物膜的形成可能與雙重或多重耐藥性有關(guān)。

針對痤瘡丙酸桿菌生物膜從植物提取的白藜蘆醇[19]、大花紅景天中提取的紅景天苷等都表現(xiàn)出了抗痤瘡丙酸桿菌生物膜的特性[20]。這些天然藥物的療效與其他抗菌藥物相當(dāng)，但不良反應(yīng)比后者要小。自誘導(dǎo)分子（autoinducers，AI）是細菌群體感應(yīng)（QS）機制中的一種分子信號，在細菌生物膜形成過程中發(fā)揮著重要作用。因此針對AI進行的藥物研發(fā)在治療生物膜相關(guān)疾病中具有廣闊的前景。Brackman等[21]發(fā)現(xiàn)兩種噻唑烷二酮類衍生物（TZD8和TZD10）是潛在的QS抑制劑，能夠在亞抑菌濃度（sub-MIC）下促進痤瘡丙酸桿菌生物膜內(nèi)細菌解聚播散而不抑制細菌生長，從而減少生物膜中生物量和代謝活躍的細菌數(shù)量。其與抗菌藥物聯(lián)用可增強生物膜對抗生素的敏感性，有效改善耐藥狀況。Bumah等[22]發(fā)現(xiàn)450 nm脈沖藍光照射可破壞痤瘡丙酸桿菌生物膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物膜解體，這表明激光治療可能是痤瘡丙酸桿菌相關(guān)疾病的一種新型治療手段。