基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術靶向敲除OsFAD2 創(chuàng)制高油酸水稻突變體

任代勝，劉 浩，喬保建

（1.安徽袁糧水稻產(chǎn)業(yè)有限公司，安徽 蕪湖 241003；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】水稻是我國重要的糧食作物，在日常飲食中作為主食為人體能量代謝提供碳水化合物。由于我國人口基數(shù)大，過去糧食供應緊缺，傳統(tǒng)的育種與栽培觀念更傾向于提高水稻的總產(chǎn)量［1］。但隨著時代的變化，改變稻米及其副產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)成為新的目標。稻谷在加工過程中被去除的碎屑組織稱為米糠或米粕，富含脂肪酸、氨基酸、花青素、多酚等物質(zhì)［2］，所提取的米糠油含有脂肪酸組分、維生素E、甾醇、谷維素等有利于人體吸收的營養(yǎng)成分，吸收率高達90%，并具有清除血液中的膽固醇、降低血脂等保健作用［3］。因此，提高并改良稻米油的營養(yǎng)組分對產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

【前人研究】米糠油中棕櫚酸約占總油脂的15%，硬脂酸含量小于3%，油酸約為45%，亞油酸變化幅度較大約為29%～42%，亞麻酸含量小于1.8%。油酸分子為18 碳烯酸，因第9 位與第10位碳原子間存在雙鍵而形成單不飽和脂肪酸。油酸含量較高的植物油對人體健康較為有益，長期食用可降低心腦血管發(fā)病率，增強人體免疫力［4］。此外，油酸分子的18 碳長鏈中僅含有單個碳-碳不飽和雙鍵（C=C），其化學分子式結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可提高油品的抗氧化能力、延長油品存儲期，因此植物高油酸育種是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主攻方向。目前油酸合成的分子機制已經(jīng)明確，脂肪酸脫飽和基因FAD2（Fatty Acid Desaturase 2）位于油酸合成通路的下游，該基因突變后阻斷油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化，進而提高油酸含量［5］?；诖嗽恚ㄟ^選育含有fad2的品種是植物高油酸育種的主要策略。木本油料作物中橄欖油與山茶油的油酸含量可占總油脂的90%以上，豆科植物中大豆與花生的高油酸品種可達70%，并且高油酸育種已經(jīng)在油菜、向日葵等大宗油料作物中廣泛開展。以水稻為代表的禾本科作物僅高油酸胚芽油有少量報道，但也只限于基礎研究層面，鑒于缺少可利用的高油酸種質(zhì)資源，產(chǎn)業(yè)化應用仍然相當落后。

【本研究切入點】傳統(tǒng)育種獲得突變體材料主要依靠誘變育種，而目標個體篩選卻費時費力。CRISPR/Cas9 基因編輯技術是通過設計靶向位點引導sgRNA 與CRISPR/Cas9 蛋白相融合，對目的基因DNA 序列進行特異性剪切，然后機體通過非末端同源重組修復受損的序列，導致核酸序列錯配、插入、缺失以實現(xiàn)目標基因突變［6］。有關利用CRISPR/Cas9 技術靶向OsFAD2及其旁系同源基因的研究鮮有報道，這限制了對油酸調(diào)控基因功能的了解。【擬解決的關鍵問題】本研究以水稻OsFAD2為目的基因，通過CRISPR/Cas9 基因編輯與轉(zhuǎn)基因技術相結(jié)合，獲得水稻高油酸突變體材料。研究結(jié)果可為后續(xù)開展水稻高油酸育種提供新的種質(zhì)資源，并為稻米油產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻材料為日本晴種子，由安徽袁糧水稻產(chǎn)業(yè)有限公司提供。供載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株為DH5α，供水稻遺傳轉(zhuǎn)化的土壤膿桿菌菌株為EHA105，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。OsU6a-sgRNA 表達盒載體與pYLCRISPR/Cas9 由華南農(nóng)業(yè)大學劉耀光院士課題組饋贈。BsaⅠ限制性內(nèi)切酶與T4 DNA 連接酶購于NEB（New England Biolabs）有限公司，瓊脂糖凝膠核酸純化回收試劑盒為OMEGA 凝膠回收試劑盒D2500-01，反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒為TOYOBO FSK-100，熒光定量PCR 試劑為ThermoFisher 公司的Fast SYBR Green Master Mix，脂肪酸檢測試劑購于Sigma-Aldrich 公司。熒光定量PCR 儀由華南農(nóng)業(yè)大學國家植物航天育種工程技術中心提供，GC-MS 連用儀由華南農(nóng)業(yè)創(chuàng)新中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1OsFAD2-sgRNA表達盒載體構(gòu)建OsFAD2基因組序列參考MSU Rice Genome Annotation Project數(shù)據(jù)庫公布的基因登錄號LOC_Os02g48560。sgRNA表達盒以Amp抗性的pUC18載體為骨架經(jīng)改造而來，大小約為3 kb。利用 CRISPRGE［7］網(wǎng)站設計OsFAD2的敲除靶點，該靶點為20 bp序列，位于第一外顯子靠近起始密碼子的位置，由Intervitrogene公司以引物的形式進行合成。OsFAD2-sgRNA表達盒構(gòu)建，利用PCR儀設置95 ℃處理靶點接頭引物（前引物：GCCGGAGGAGCAGAAGCTGCT，后引物：AAACAGCAGCTTCTGCTCCTC）30 s，用T4 DNA連接酶將靶點接頭引物與BsaⅠ酶切后的pYLCRISPR/OsU6a-sgRNA載體相連，利用特定載體引物（前引物：CTCCGTTTTACCTGTGGA ATCG，后引物：CGGAGGAAAATTCCATCCAC）擴增OsU6a-FAD2-sgRNA序列，PCR產(chǎn)物切膠純化后備用。

1.2.2 單靶點pYLCRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA載體構(gòu)建 利用BsaⅠ酶切載體pYLCRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切載體片段，切膠純化回收。再利用BsaⅠ單酶切OsU6a-FAD2-sgRNA 的PCR 產(chǎn)物，充分酶切后直接利用Omega DNA 純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，全部線性化的純化片段利用 T4 連接酶于20 ℃連接2 h 后，將10 μL 連接產(chǎn)物加入到100 μL 的DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞于42 ℃進行熱激法轉(zhuǎn)化。陽性克隆子鑒定采用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA，利用AscⅠ酶切進行驗證，陽性克隆經(jīng)Sanger 測序后確定Cas9-FAD2-sgRNA 載體構(gòu)建成功［8］。

1.2.3OsFAD2敲除植株的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建 將構(gòu)建的Cas9-FAD2-sgRNA 載體轉(zhuǎn)化土壤膿桿菌，含有陽性載體的農(nóng)桿菌菌株侵染日本晴的愈傷組織，共培養(yǎng)3 d 后，轉(zhuǎn)移侵染后的愈傷于潮霉素抗性培養(yǎng)基篩選2 次共40 d，愈傷再經(jīng)過分化、生根獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。采用CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片基因組DNA，在距離靶點上下游約200 bp 的位置設計引物，通過PCR 反應與Sanger測序鑒定靶點序列突變情況，并將陽性植株（T0代）練苗后栽至溫室，所產(chǎn)生的種子繼續(xù)栽種至T1代［9］。

1.2.4OsFAD2表達量檢測 取0.1 g 葉片經(jīng)液氮研磨，加入1 mL Invitrogene 的TRIZOL 試劑靜置；加入300 μL 氯仿，13 000 r/min 離心5 min，取上清液400 μL 并加入等體積異丙醇，13 000 r/min離心5 min，70%無水乙醇洗滌，DEPC 水溶解總RNA。取1 μg 總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒FSK-100 獲得全長cDNA，以此作為模版，采用ABI StepOne Plus 系統(tǒng)，使用SYBR Premix ExTaq 進行熒光定量PCR 檢測，反應體系為20 μL，用2-ΔΔct法計算目標基因各組織的相對表達量，以野生型日本晴植株作為對照［10］。

1.2.5OsFAD2敲除植株籽粒脂肪酸組分檢測脂肪酸檢測所用試劑，包括脂肪酸標品（Sigma-Aldrich）、三氯甲烷（Sigma-Aldrich）、甲醇（色譜純）、石油醚、乙醚、氫氧化鉀，所用儀器為安捷倫GC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀7890A+5975C，色譜柱為DB-225MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣量1 μL，氣化溫度280 ℃，分流比10 ∶1，載氣為氦氣（99.999%），流量1 mL/min，柱溫初始溫度50 ℃，5 ℃/min 升溫至200 ℃，2 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。色譜條件依次檢測各標準溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算得到各種標準曲線。稱取水稻籽粒研磨后0.2 g 樣品，加入0.5 mL 石油醚一乙醚混合液，渦旋振蕩、靜置1 h，4 000 r/min 離心1 min，加入0.25 mL氫氧化鉀一甲醇溶液為甲酯化試劑，渦旋振蕩、靜置1 h，再次渦旋振蕩，加入0.5 mL去離子水，靜置30 min 分層、以4 500 r/min 離心2 min、取上清液，供氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。對樣品質(zhì)譜峰圖與標準品峰圖進行比對，計算各組分相對含量［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsFAD2 基因與蛋白序列特性分析

水稻OsFAD2（LOC_Os02g48560）位于第2條染色體上，基因序列5 244 bp，僅含有1 個外顯子區(qū)段，該基因的信使RNA 同時包含3 種可變剪切形式，大小分別為1 359、1 166、1 148 bp（圖1A）。其中可變剪切轉(zhuǎn)錄本OsFAD2-1的蛋白序列長度452 個氨基酸，在72～137 aa 處含有保守的DUF3474 結(jié)構(gòu)域，在155～416 aa 處含有脂肪酸脫飽和酶結(jié)構(gòu)域；OsFAD2-2與OsFAD2-3蛋白序列長度相似，僅有少量氨基酸缺失差異，兩者分別在18～73 aa 與85～353 aa 處含有保守的DUF3474 與脂肪酸脫飽和酶結(jié)構(gòu)域（圖1B）。由此推測，雖然OsFAD2具有3 種不同的可變剪切轉(zhuǎn)錄本，但是所編碼的蛋白均含有保守的脂肪酸脫飽和酶結(jié)構(gòu)域，該保守區(qū)段可能是其促進油酸脫氫后產(chǎn)生亞油酸的主要結(jié)構(gòu)。

圖1 OsFAD2 基因與蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic gene and protein structures of OsFAD2

2.2 OsFAD2 組織表達量分析

為明確OsFAD2能否在種子內(nèi)具有表達活性，利用RiceXPro數(shù)據(jù)庫［12］檢索OsFAD2基因表達量，數(shù)據(jù)經(jīng)過整合重新分析后發(fā)現(xiàn)，OsFAD2在營養(yǎng)生長階段的表達量以在葉片中最高，其次是葉鞘，在莖與根中表達量較低，表明該基因在地上部分組織的表達水平整體高于地下部分。而進入生殖生長階段，該基因在種子內(nèi)稃中的表達量最高，而在受精后胚以及胚乳中的表達量略高于花序、花藥、雌蕊和子房，總體而言在種子發(fā)育過程中的表達量要高于營養(yǎng)生長階段葉片的表達量（圖2），表明該基因?qū)τ谧蚜７e累脂肪酸的調(diào)控有重要的生物學功能。組織表達量分析也明確了該基因的潛在功能，若該基因不能在水稻籽粒發(fā)育階段表達，則后續(xù)開展CRISPR/Cas9 基因敲除將失去實際意義。

圖2 OsFAD2 在不同組織內(nèi)的基因表達模式分析Fig.2 Analysis of gene expression pattern of OsFAD2 in different tissues

2.3 CRISPR/Cas9 誘導的OsFAD2 敲除植株檢測

針對OsFAD2基因3 個可變剪切的共有序列設計CRISPR/Cas9 敲除的單個靶點，該引導RNA的位置位于編碼區(qū)距離起始密碼子（ATG）250 bp 處。最終構(gòu)建好的Cas9-FAD2-sgRNA 經(jīng)酶切與測序驗證表明，F(xiàn)AD2-sgRNA 表達盒與玉米泛素化啟動子Ubi 驅(qū)動的Cas9 蛋白連接成功（圖3A）。

利用農(nóng)桿菌介導法將表達載體轉(zhuǎn)入日本晴的愈傷組織，以30 個長勢良好的愈傷組織團聚體作為外植體進行轉(zhuǎn)染，經(jīng)潮霉素抗性標記篩選后獲得17 株轉(zhuǎn)基因再生苗。其中4 株為白化苗且未能存活，5 株未能產(chǎn)生突變，剩余8 株的OsFAD2序列均有堿基突變，總體轉(zhuǎn)化效率接近50%，可見該類載體的編輯效率非常高。經(jīng)過序列比對后，最終確定了3 個獨立的轉(zhuǎn)基因T0代植株，命名為fad2-1、fad2-2、fad2-3。T0代轉(zhuǎn)基因植株測序結(jié)果表明，fad2-1同時存在缺失與堿基替換，fad2-2在靶點位置均為堿基替換，fad2-3有1 個位點發(fā)生堿基缺失，其余均為堿基替換類型。由于T0代植株屬于嵌合體，因而與野生型植株相比在進行測序時，峰圖均存在雙峰現(xiàn)象，該結(jié)果屬于正?，F(xiàn)象（圖3B）。同時，利用CRISPR-GE網(wǎng)站預測所設計靶點的潛在脫靶基因，篩選發(fā)現(xiàn)有10 個基因的編碼區(qū)序列可能是潛在的敲除位點，經(jīng)序列檢測后發(fā)現(xiàn)，fad2-1不存在脫靶現(xiàn)象，而fad2-2與fad2-3均有脫靶現(xiàn)象（表1），表明fad2-1可作為陽性植株開展后續(xù)脂肪酸檢測試驗。

表1 CRISPR-GE 預測的脫靶基因信息Table 1 List of off-target genes predicted by CRISPR-GE

本試驗收獲3 個獨立T0代株系的種子，進行擴繁得到T1代植株，但檢測T1代植株靶點時發(fā)現(xiàn)，fad2-2與fad2-3產(chǎn)生的種子后代在敲除靶點全部變?yōu)檎Ｐ蛄?，原本T0代的變異序列被同源重組修復后變成了與野生型一致的序列，加之該兩個株系存在脫靶現(xiàn)象，因此不可作為后續(xù)試驗材料。而fad2-1在敲除靶點存在3 個堿基缺失與堿基替換現(xiàn)象，表明fad2-1為純合株系，并且測序峰圖并未出現(xiàn)嚴重的雙峰現(xiàn)象（圖3C）。熒光定量PCR 檢測fad2-1兩個獨立株系的OsFAD2基因表達量，結(jié)果顯示該基因的表達量顯著低于野生型內(nèi)的表達水平（圖3D），可見本研究獲得了穩(wěn)定性遺傳的CRISPR/Cas9 敲除OsFAD2的轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 OsFAD2 的CRISPR/Cas9 敲除植株驗證Fig.3 Validation of OsFAD2 knock-outed plants via CRISPR/Cas9

2.4 OsFAD2 轉(zhuǎn)基因敲除植株籽粒的脂肪酸組分檢測

經(jīng)驗證明確fad2-1為陽性敲除植株后，我們收獲了兩個獨立株系的轉(zhuǎn)基因種子，利用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測脫殼后種子的脂肪酸含量，結(jié)果表明，棕櫚酸（C16∶0）含量在fad2-1中略有減少，但是單不飽和棕櫚酸（C16∶1）含量有所增加；18 碳長鏈脂肪酸中的硬脂酸（C18∶0）含量雖在敲除植株中有所減少，但該類脂肪酸總體含量較少，未達到顯著差異；油酸（C18∶1）含量則明顯發(fā)生變化，其含量顯著高于野生型中的含量，而相應的亞油酸（C18∶2）含量則出現(xiàn)顯著下降，亞麻酸（C18∶3）含量總體變化不大（圖4）。通過種子脂肪酸組分含量檢測可以確定，OsFAD2突變后對油酸含量的增加有顯著促進作用。本研究通過利用CRISPR/Cas9 敲除OsFAD2獲得了穩(wěn)定遺傳的高油酸稻突變體材料。

圖4 OsFAD2 敲除突變體植株種子的脂肪酸組分檢測Fig.4 Detection of fatty acid composition in OsFAD2 knock-outed mutants

3 討論

CRISPR/Cas9 基因定點編輯技術具有突變效率高、載體構(gòu)建簡便的優(yōu)勢，是水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新的前沿技術，與傳統(tǒng)獲得突變體的方式不同，通過靶向引導RNA 的介入，CRISPR/Cas9 蛋白酶可對DNA 序列進行高效剪切，機體的非同源重組修復再產(chǎn)生多種類型的堿基變異模式［13］。而后續(xù)通過雜交或輪回選擇的方式可剔除內(nèi)源性插入的CRISPR/Cas9 蛋白的編碼序列與篩選標記，該技術與傳統(tǒng)育種方式的有效結(jié)合可構(gòu)建水稻基因突變體庫［14］。本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對水稻脂肪酸脫飽和酶基因OsFAD2編碼區(qū)序列進行定點編輯，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的高油酸種質(zhì)材料，為后續(xù)開展高油酸水稻育種奠定了基礎。

OsFAD2在水稻體存在4 個同源基因，本研究主要針對OsFAD2-1（LOC_Os02g48560）進行研究，其他3 個同源基因如OsFAD2-2（LOC_Os07g23430）、OsFAD2-3（LOC_Os07g23410）、OsFAD2-4（LOC_Os07g23390）均被預測定位于第7 條染色體上，三者是否具有與OsFAD2-1類似的功能仍有待深入研究，若采用CRISPR/Cas9 基因編輯創(chuàng)制三者的突變體，則能夠有效解釋水稻OsFAD2及其同源基因之間的功能冗余性問題［15］。此外，OsFAD2突變體不僅能夠被應用于實際育種工作，還可以作為基礎研究材料用于研究水稻脂肪酸合成代謝的分子機制。此前有研究報道OsFAD2-1的RNAi 干擾植株可表達生成高油酸米糠油，米糠油具有較高的氧化穩(wěn)定性，無需加氫過程而直接被用于食品工業(yè)［16］。敲減OsFAD2-1基因表達會伴隨脂質(zhì)合成通路中多個關鍵基因表達下調(diào)，表明該基因能夠在整體水平上影響種子脂肪酸的合成［17-18］。本研究鑒定到敲除OsFAD2導致該基因喪失表達能力，可顯著提高油酸含量，并且發(fā)現(xiàn)單不飽和棕櫚酸（C16∶1）含量有所增加，該結(jié)果與花生中高油酸突變體結(jié)果類似，花生FAD2突變后也可以提高C16∶1 含量［19］，但具體機制仍有待深入研究。因此，利用OsFAD2突變體可為水稻脂肪酸合成代謝研究提供新的切入點。

我國是水稻生產(chǎn)大國，每年總產(chǎn)量約2 億t，米糠等副產(chǎn)品的產(chǎn)量約占6.5%，粗略估計如充分利用可產(chǎn)稻米油180 萬t，相當于1 000 多萬t 大豆的含油量，可緩解食用油供給壓力［20］。隨著我國稻米精深加工業(yè)整體水平的提高，以及人們對油類產(chǎn)品營養(yǎng)保健作用的重視，米糠油的產(chǎn)業(yè)鏈正在逐步發(fā)展壯大。油酸含量較高的植物油營養(yǎng)價值、貨架存儲期均優(yōu)于普通植物油，現(xiàn)已成為衡量植物油價格高低的評價標準，例如橄欖油、山茶油等價格是普通植物油的5～10 倍［21］。因此，大力推廣高產(chǎn)、高油酸水稻品種能夠促進稻米油產(chǎn)業(yè)全面發(fā)展，本研究所創(chuàng)制的高油酸水稻種質(zhì)資源則具有潛在的產(chǎn)業(yè)應用價值。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得OsFAD2的突變體材料，為水稻高油酸育種提供了新的種質(zhì)資源。通過水稻全生育期基因轉(zhuǎn)錄表達量分析發(fā)現(xiàn)，OsFAD2的表達量在生殖生長階段顯著高于營養(yǎng)生長階段，表明該基因可調(diào)控籽粒中的油酸合成。鑒于CRISPR/Cas9 基因編輯可特異性敲除目標DNA 序列，本研究所設計的敲除靶點位于OsFAD2起始密碼子（ATG）下游約250 bp 處，因此創(chuàng)制出新OsFAD2突變類型。其遺傳特性穩(wěn)定的T1代轉(zhuǎn)基因植株油酸含量比野生型植株提高了25%～30%，而種子亞油酸含量相應減少約35%，該結(jié)果表明通過靶向敲除OsFAD2的編碼序列，可有效改良水稻油酸及其他脂肪酸的組成。