高延芳,查政,薛冰,李君玲,齊放,金良韻,張楠,樊永平,王蕾
補(bǔ)腎益髓方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型miRNA-155信號(hào)通路相關(guān)因子的影響
高延芳1,查政1,薛冰2,李君玲1,齊放1,金良韻2,張楠1,樊永平3,王蕾1
1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院,北京 100070
觀察補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2神經(jīng)炎癥的影響,探討其可能的作用機(jī)制。1 μg/mL脂多糖(LPS)誘導(dǎo)建立BV2細(xì)胞炎癥模型,將BV2細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、LPS組、補(bǔ)腎益髓方藥物血清(5%、10%、20%)組和空白血清(5%、10%、20%)組,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力;在此基礎(chǔ)上,將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,免疫熒光法和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arginase-1)蛋白表達(dá),RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-155-5p表達(dá);采用慢病毒轉(zhuǎn)染制備miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)模型,另設(shè)20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組,免疫熒光法和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS、Arginase-1及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)蛋白表達(dá)。與正常組比較,LPS組細(xì)胞活力顯著降低(<0.01),iNOS和miRNA-155-5p水平顯著升高(<0.01),Arginase-1表達(dá)顯著降低(<0.05);與LPS組比較,20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組細(xì)胞活力顯著升高(<0.01),iNOS和miRNA-155-5p水平顯著降低(<0.01),Arginase-1表達(dá)顯著升高(<0.01)。與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組iNOS表達(dá)顯著升高(<0.01),Arginase-1和C/EBPβ表達(dá)顯著降低(<0.01)。補(bǔ)腎益髓方可抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng),其作用機(jī)制與提高細(xì)胞活力、上調(diào)Arginase-1表達(dá)、下調(diào)iNOS表達(dá)、抑制miRNA-155信號(hào)通路有關(guān)。
補(bǔ)腎益髓方;神經(jīng)炎癥;BV2細(xì)胞;脂多糖;miRNA-155信號(hào)通路
多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種自身免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)慢性炎癥退行性疾病,以炎癥、脫髓鞘和軸突損傷為主要病理特征,臨床表現(xiàn)為肢體無(wú)力、麻木疼痛,視力下降等。研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的固有免疫細(xì)胞,參與MS病變形成的各個(gè)階段,是炎癥的驅(qū)動(dòng)因素。在炎癥病理情況下,病灶周圍區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞被不斷激活,極化為促炎型M1和抑炎型M2。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子和趨化因子,損傷髓鞘;M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎因子和營(yíng)養(yǎng)因子,吞噬消除病原體,并修復(fù)髓鞘[1-4]。在MS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)上調(diào),M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1(Arginase-1)表達(dá)下調(diào),同時(shí)分泌大量促炎因子,導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變[5-6],后期出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知功能障礙等[7]。另有研究表明,miRNA-155及其下游靶基因CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein β,C/EBPβ)可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化,參與炎癥反應(yīng)[8]。
補(bǔ)腎益髓方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院樊永平教授研發(fā)的治療MS方劑,以補(bǔ)腎填精、化痰活血為主,療效顯著[9]。課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示,補(bǔ)腎益髓方可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,促進(jìn)髓鞘再生[10-11],但其作用機(jī)制尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2建立神經(jīng)炎癥模型,觀察補(bǔ)腎益髓方是否通過(guò)miRNA-155信號(hào)通路介導(dǎo)BV2細(xì)胞向M2型極化,為明確補(bǔ)腎益髓方治療MS的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
SPF級(jí)雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量(280±20)g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006,動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2018-0003。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度18~22 ℃,相對(duì)濕度40%~60%,自由攝食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(AEEI-2018-137)。小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2,北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。
補(bǔ)腎益髓方(生地黃12 g,熟地黃12 g,制何首烏9 g,水蛭6 g,連翹9 g,全蝎6 g,浙貝母12 g,天麻9 g,益母草12 g,酒大黃6 g),飲片粉末購(gòu)自北京亞?wèn)|生物制藥有限公司,使用前用蒸餾水溶解,配制成原藥材濃度為1.46 g/mL藥液。LPS,貨號(hào)PB10443,美國(guó)Sigma公司,配制成濃度為1 mg/mL貯備液,0.22 μm濾膜過(guò)濾,分裝后于-20 ℃冰箱保存,臨用前用培養(yǎng)基稀釋,終濃度為1 μg/mL。
DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)10-013-CV)、青鏈霉素(貨號(hào)15140-122)、胎牛血清(貨號(hào)35-076-CV),美國(guó)Corning公司;小鼠抗iNOS一抗(貨號(hào)ab210823)、兔抗Arginase-1一抗(貨號(hào)ab91279)、兔抗C/EBPβ一抗(貨號(hào)ab32358),英國(guó)Abcam公司;小鼠抗β-tubulin一抗(貨號(hào)YM3030),美國(guó)Immunoway公司;慢病毒,上海漢恒生物科技有限公司。ESCD AC2-4S1超凈生物安全柜(美國(guó)Thermo公司),371型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司),Primo Vert倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司),Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司),小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司),PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源(美國(guó)Bio-Rad公司),F(xiàn)usion FX6-XT化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(法國(guó)Vilber公司),SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司),CFX Connect熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為空白血清組和補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,每組15只。補(bǔ)腎益髓方藥物血清組大鼠參照文獻(xiàn)[12]予補(bǔ)腎益髓方藥液(11.7 g/kg)灌胃,空白血清組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)7 d,每日2次,間隔12 h。末次給藥前禁食12 h,末次給藥后2 h麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,4 ℃靜置4 h,3 000 r/min離心15 min,吸取上清液,合并同組血清,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
取生長(zhǎng)良好的BV2細(xì)胞,加入1 μg/mL LPS誘導(dǎo)24 h,建立體外炎癥模型。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于96孔板,每孔100 μL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組,LPS組,5%、10%、20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,5%、10%、20%空白血清組,每組5個(gè)復(fù)孔。24 h后各組棄去培養(yǎng)液,正常組加入新鮮培養(yǎng)液,其余各組加入LPS干預(yù)24 h。24 h后棄去培養(yǎng)液,正常組和LPS組加入新鮮培養(yǎng)液,各濃度血清組加入相應(yīng)濃度血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值÷正常組OD值×100%。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于24孔板,每孔500 μL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,每組3個(gè)復(fù)孔,按“2.2”項(xiàng)下方法造模,24 h后棄去培養(yǎng)液,正常組和LPS組加入新鮮培養(yǎng)液,20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組加入相應(yīng)濃度血清培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定20 min,0.5%Triton X-100通透20 min,5%BSA封閉30 min。加入小鼠抗iNOS一抗(1∶200)和兔抗Arginase-1一抗(1∶200),4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。次日滴加相應(yīng)二抗(1∶200),室溫孵育2 h,滴加熒光染料DAPI,避光孵育5 min,倒置熒光顯微鏡下觀察,每孔選取3個(gè)視野拍照。應(yīng)用Image J 18.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行半定量分析,測(cè)量平均熒光強(qiáng)度,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于6孔板,每孔2 mL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,每組3個(gè)復(fù)孔,按“2.2”項(xiàng)下方法造模,按“2.4”項(xiàng)下方法給藥。將6孔板置于冰上,吸棄培養(yǎng)液,PBS清洗3次,加入60 μL蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液(1∶100)混合溶液,置于搖床上裂解30 min,將各組液體分別收集至EP管內(nèi),4 ℃、12 000 r/min離心20 min,吸取上清液至新EP管內(nèi),BCA檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取各組蛋白樣品(20 μg)進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉,常溫?fù)u床封閉1 h。分別加入iNOS一抗(1∶500)、Arginase-1一抗(1∶500),4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。次日TBST清洗3次,每次5 min,滴加相應(yīng)二抗(1∶20 000),常溫?fù)u床孵育30 min,TBST清洗3次,每次5 min。將ECL發(fā)光試劑A液與B液等體積混勻后滴在PVDF膜上,并于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像。采用Image J 18.0軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-tubulin)條帶灰度值的比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于6孔板,每孔2 mL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組,每組3個(gè)復(fù)孔,按“2.2”項(xiàng)下方法造模,并按“2.4”項(xiàng)下方法給藥。培養(yǎng)48 h后,PBS清洗3次,每次5 min,按細(xì)胞總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。Bestar?one step RT qPCR kit(SyBR Green)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)定各組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p表達(dá)情況。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量。miRNA-155-5p和U6 snRNA(U6)引物由北京賽維爾生物公司合成,miRNA-155-5p引物設(shè)計(jì)采用莖環(huán)法,需要3種引物:反轉(zhuǎn)錄引物用于延長(zhǎng)miRNA-155-5p、RT-qPCR上游引物、RT-qPCR下游引物。U6作為miRNA-155-5p的內(nèi)源性對(duì)照。引物序列見表1。
表1 各基因PCR引物序列
基因名稱引物序列(5’~3’)產(chǎn)物長(zhǎng) 度/bp miRNA-155-5p 反轉(zhuǎn)錄:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGACCCCTAT F:ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT67 R:TGGTGTCGTGGAGTCG U6F:CTCGCTTCGGCAGCACA94 R:AACGCTTCACGAATTTGCGT
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于24孔板,每孔500 μL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。慢病毒轉(zhuǎn)染按漢恒生物操作手冊(cè)執(zhí)行。在冰上慢慢融化,吸去舊培養(yǎng)液,加入1/2體積新鮮培養(yǎng)液,根據(jù)摸索的感染復(fù)數(shù)(MOI)值,加入適量體積慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每孔加入體積(μL)=MOI×細(xì)胞數(shù)/病毒滴度(TU/mL)×1 000。根據(jù)漢恒生物測(cè)定的病毒滴度(108TU/mL)及前期摸索的MOI值(60)計(jì)算得出24孔板每孔加入病毒15 μL,慢病毒轉(zhuǎn)染4 h后補(bǔ)足至培養(yǎng)體積。轉(zhuǎn)染24 h后棄去含有慢病毒的培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后可通過(guò)熒光顯微鏡初步觀察帶有綠色熒光蛋白的BV2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染72 h后觀察到帶有綠色熒光蛋白的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的80%~90%,表明陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組制備成功。
取正常BV2細(xì)胞及慢病毒轉(zhuǎn)染后的BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于24孔板,每孔500 μL,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組,每組3個(gè)復(fù)孔。24 h后棄去培養(yǎng)液,各組加入LPS干預(yù)24 h,棄去含LPS的培養(yǎng)液,各組加入含20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。按“2.4”項(xiàng)下免疫熒光操作步驟,并在操作中補(bǔ)充兔抗C/EBPβ抗體(1∶200),檢測(cè)iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常BV2細(xì)胞及慢病毒轉(zhuǎn)染后的BV2細(xì)胞,以5×104個(gè)/mL接種于6孔板,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組,每組3個(gè)復(fù)孔。按“2.8”項(xiàng)下方法造模并給藥,按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),并在操作中補(bǔ)充兔抗C/EBPβ抗體(1∶500),檢測(cè)iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)。
與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞活力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01);5%、10%、20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后,細(xì)胞活力顯著升高,與對(duì)應(yīng)空白血清組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05,<0.01),其中20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組效果最明顯,與5%、10%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01)。見圖1。故選擇20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注:與正常組比較,**P<0.01;與同濃度空白血清組比較,#P<0.05,##P<0.01;與5%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,▲▲P<0.01;與10%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,△△P<0.01
免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著上調(diào)(<0.01),Arginase-1表達(dá)顯著下調(diào)(<0.05);與LPS組比較,20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著下調(diào)(<0.01),Arginase-1表達(dá)顯著上調(diào)(<0.01)。見圖2、表2、圖3、表3。
圖2 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1陽(yáng)性表達(dá)(免疫熒光染色,×200)
表2 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1表達(dá)比較(±s,平均熒光強(qiáng)度)
注:與正常組比較,*<0.05,**<0.01;與LPS組比較,★★<0.01
注:A.正常組;B. LPS組;C. 20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組
表3 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1蛋白表達(dá)比較(±s,相對(duì)表達(dá)量)
注:與正常組比較,*<0.05,**<0.01;與LPS組比較,★★<0.01
與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著升高(<0.01);與LPS組比較,20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著降低(<0.01)。見表4。
表4 各組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平比較(±s)
注:與正常組比較,**<0.01;與LPS組比較,★★<0.01
免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著升高(<0.01),C/EBPβ、Arginase-1表達(dá)顯著降低(<0.05,<0.01)。見圖4、表5、圖5、表6。
圖4 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ陽(yáng)性表達(dá)(免疫熒光染色,×200)
表5 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ表達(dá)比較(±s,平均熒光強(qiáng)度)
注:與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,☆☆<0.01
注:A. 20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組;B.陰性對(duì)照組;C. miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組
表6 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)比較(±s,相對(duì)表達(dá)量)
注:與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較,☆<0.05,☆☆<0.01
大多數(shù)MS患者出現(xiàn)肢體筋脈弛緩、軟弱無(wú)力,不能隨意運(yùn)動(dòng),或伴有肌肉萎縮,甚至癱瘓。根據(jù)臨床表現(xiàn),MS可歸屬中醫(yī)學(xué)“痿證”范疇。目前臨床對(duì)MS急性期常采用糖皮質(zhì)激素治療,緩解期則使用疾病修正治療,但西醫(yī)治療方案對(duì)神經(jīng)再生治療效果欠理想[13-14]。近年來(lái),中醫(yī)治療MS取得一定療效。MS病位在腦髓,腎主骨生髓,腎氣不足,髓海失養(yǎng),筋骨失約,致機(jī)體不能隨意運(yùn)動(dòng),最終導(dǎo)致痿證[15-16]。補(bǔ)腎益髓方由生地黃、熟地黃、酒大黃、益母草、浙貝母、水蛭、全蝎、天麻、連翹組成,其中生地黃和熟地黃補(bǔ)腎填精,充養(yǎng)腦髓,配伍浙貝母、益母草、水蛭、全蝎等化痰活血通絡(luò),以利于腦髓的充養(yǎng)[9,17]。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎益髓方能抑制EAE小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志物iNOS表達(dá),提高M(jìn)2型標(biāo)志物Arginase-1表達(dá)[18]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),LPS刺激后,BV2細(xì)胞M1型細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β分泌增加,M2型細(xì)胞因子如IL-10分泌減少[19]。本實(shí)驗(yàn)選用1 μg/mL LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞24 h建立體外神經(jīng)炎癥模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS刺激后,BV2細(xì)胞活力明顯下降,且iNOS表達(dá)顯著上調(diào),Arginase-1表達(dá)顯著下調(diào),提示炎癥模型建立成功。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20],本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了5%、10%、20%濃度的補(bǔ)腎益髓方藥物血清,利用CCK-8法篩選最佳血清濃度。結(jié)果表明,20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后,BV2細(xì)胞活力明顯升高,Arginase-1蛋白表達(dá)上調(diào),iNOS蛋白表達(dá)下調(diào),提示補(bǔ)腎益髓方含藥血清可促進(jìn)BV2細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18]。
miRNAs作為非編碼小分子RNA,在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起著重要作用。一些miRNAs已成為炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的基因表達(dá)調(diào)控因子。miRNA-155是一種特異性miRNA,參與神經(jīng)退行性疾病炎癥反應(yīng)[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn),LPS可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞向M1型極化,同時(shí)檢測(cè)到miRNA-155水平上調(diào)[23],miRNA-155過(guò)表達(dá)可使BV2細(xì)胞吞噬活性降低,無(wú)法吞噬殘存的髓鞘碎片[24],而miRNA-155敲減可促進(jìn)M2型細(xì)胞因子分泌,抑制M1型細(xì)胞因子分泌[25]。深入研究發(fā)現(xiàn),miRNA-155通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)EAE小鼠病程[26-27]。C/EBPβ是miRNA-155的下游靶基因,miRNA-155通過(guò)靶向C/EBPβ參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化,miRNA-155過(guò)表達(dá)可抑制C/EBPβ活性及巨噬細(xì)胞向M2型極化[28],而miRNA-155敲減可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化及C/EBPβ表達(dá)[29]。本研究結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)后,BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著上調(diào),提示炎癥與miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)有關(guān),而經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療后,miRNA-155-5p水平明顯降低,說(shuō)明補(bǔ)腎益髓方減輕炎癥反應(yīng)與抑制miRNA-155-5p表達(dá)密切相關(guān)。進(jìn)一步采用慢病毒轉(zhuǎn)染制備miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)模型,再經(jīng)補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后抗炎作用不明顯,說(shuō)明補(bǔ)腎益髓方是通過(guò)miRNA-155介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。
綜上所述,補(bǔ)腎益髓方對(duì)神經(jīng)炎癥有明顯抑制作用,其作用機(jī)制可能為抑制miRNA-155和調(diào)控其下游基因C/EBPβ表達(dá),促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化。本研究可為明確補(bǔ)腎益髓方治療MS的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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Effects ofPrescription for miRNA-155 Signaling Pathway Related Factors on Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammation in BV2 Cells
GAO Yanfang1, ZHA Zheng1, XUE Bing2, LI Junling1, QI Fang1, JIN Liangyun2,ZHANG Nan1, FAN Yongping3, WANG Lei1
To observe the effects ofPrescription-containing drug serum on the inflammation of BV2 microglial cells; To explore its possible mechanism against neuroinflammation.1 μg/mL LPS was used to induced BV2 cell inflammation model. The BV2 microglial cells were randomly divided into normal group, LPS group,Prescription-containing drug serum (5%, 10%, 20%) group and blank serum (5%, 10%, 20%) group, the cell viability was detected by CCK-8 assay. On the basis of experiments, the cells were divided into normal group, LPS group and 20%Prescription-containing drug serum group. The expressions of iNOS and Arginase-1 in cells were detected by immunofluorescence and Western blot, and the expression level of miRNA-155-5p in cells was measured by RT-qPCR. The miRNA-155-5p overexpression model were prepared by lentiviral transfection, the cells were divided into 20%Prescription-containing serum group, negative control group and miRNA-155-5p overexpression group, the expressions of iNOS, Arginase-1 and C/EBPβ in cells were detected by immunofluorescence and Western blot.Compared with the normal group, the cell viability of the LPS group was significantly reduced (<0.01), the levels of iNOS and miRNA-155-5p significantly increased, and the expression of Arginase-1 was significantly reduced (<0.05). Compared with the LPS group, the cell viability of the 20%Prescription-containing drug serum group significantly increased (<0.01), the levels of iNOS and miRNA-155-5p were significantly reduced (<0.01), and the expression of Arginase-1 significantly increased (<0.01). Compared with the 20%Prescription-containing drug serum group, the expression of iNOS in the miRNA-155-5p overexpression group was significantly increased (<0.01), and the expression of Arginase-1 and C/EBPβ was significantly decreased (<0.01).Prescription can inhibit LPS-induced inflammatory reaction in BV2 cells, and its mechanism of action is related to improving cell viability, up-regulating the expression of Arginase-1, down-regulating the expression of iNOS, and inhibiting the miRNA-155 signaling pathway.
Prescription; neuroinflammatory; BV2 microglial cells; lipopolysaccharide; miRNA-155 signaling pathway
R285.5
A
1005-5304(2021)12-0061-07
10.19879/j.cnki.1005-5304.202105378
國(guó)家自然科學(xué)基金(81873252)
王蕾,E-mail:tmwangl@ccmu.edu.cn
(2021-05-23)
(修回日期:2021-06-16;編輯:鄭宏)