扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、遷移及旁分泌能力的影響

欒玉玲，花東明，陳相波，王芳，孔曉妮，馮煜

扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、遷移及旁分泌能力的影響

欒玉玲1，花東明1，陳相波2，王芳1，孔曉妮1，馮煜1

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200120；2.杭州榮澤生物科技集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 311200

觀察扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSCs）增殖、遷移及旁分泌能力的影響。貼壁法分離HUCMSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定HUCMSCs表型并檢測其分化能力；取第5代HUCMSCs，隨機(jī)分為空白血清組及5%、10%、15%藥物血清組，CCK-8法檢測HUCMSCs增殖能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HUCMSCs增殖能力；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HUCMSCs遷移能力，測量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HUCMSCs遷移能力，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)目。ELISA檢測HUCMSCs旁分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）能力。分離培養(yǎng)的HUCMSCs高表達(dá)標(biāo)志物CD90（99.8%）、CD105（97.1%）、CD73（99.9%）、CD44（100%），符合HUCMSCs表型特征并具有成脂/成骨分化功能。CCK-8結(jié)果顯示，5%、10%、15%藥物血清干預(yù)HUCMSCs后，均能促進(jìn)HUCMSCs增殖（＜0.05）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs克隆形成數(shù)量增加。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組干預(yù)后，HUCMSCs遷移率明顯升高（＜0.01），且隨藥物血清濃度增加，細(xì)胞遷移率呈上升趨勢。ELISA結(jié)果顯示，與同一時點(diǎn)空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs旁分泌bFGF能力明顯增強(qiáng)（＜0.05）。扶正化瘀方藥物血清對HUCMSCs增殖、遷移和旁分泌bFGF能力有明顯促進(jìn)作用。

扶正化瘀方；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；旁分泌

肝纖維化是肝臟對反復(fù)慢性炎癥、壞死等損傷無效修復(fù)后形成的瘢痕組織，隨著其程度加重，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。目前尚無特效藥物進(jìn)行治療，臨床以肝移植術(shù)作為終末期肝病唯一有效的治療手段，但供體缺乏及免疫排斥限制其廣泛應(yīng)用[1]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSCs）移植術(shù)作為治療肝纖維化的有效方案，其臨床有效性不斷得到證實(shí)[2-3]。但HUCMSCs在體外誘導(dǎo)增殖效率低、生物學(xué)功能易受培養(yǎng)環(huán)境影響，及其向肝臟遷移能力低等仍是亟待解決的問題[4]。扶正化瘀方可顯著改善慢性丙型肝炎患者肝功能及肝纖維化程度[5]?；A(chǔ)研究表明，扶正化瘀方可降低肝纖維化小鼠肝纖維化程度[6]。但扶正化瘀方能否通過增強(qiáng)HUCMSCs功能發(fā)揮對肝纖維化的治療作用，目前尚無相關(guān)研究。本研究采用血清藥理學(xué)方法，觀察扶正化瘀方藥物血清對體外培養(yǎng)的HUCMSCs增殖、遷移和旁分泌能力的影響，以期為終末期肝病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠20只，12周齡，體質(zhì)量200～250 g，浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0001，動物使用許可證號SYXK（滬）2020-0009。飼養(yǎng)于溫度20 ℃、相對濕度60%環(huán)境，12 h明暗交替，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批（PZSHUTCM201106014）。

1.2 藥物

扶正化瘀方浸膏粉（丹參4 g，桃仁2 g，絞股藍(lán)6 g，松花粉2 g，冬蟲夏草菌絲8 g，五味子2 g），由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供。使用前稱取適量扶正化瘀方浸膏粉，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，配制成濃度?.24 g/mL溶液。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：每24 g扶正化瘀方浸膏粉中丹酚酸B不少于15.6 mg、丹參素鈉不少于13.2 mg、五味子乙素不少于2.28 mg、冬蟲夏草菌絲腺苷不少于4.8 mg。

1.3 主要試劑與儀器

Transwell培養(yǎng)小室（美國Costar，貨號3422），CCK-8檢測試劑盒（英國Abcam，貨號ab228554），成脂染色試劑盒（美國Cyagen，貨號HUXUC-90031），成骨染色試劑盒（美國Cyagen，貨號HUXUC-90021），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物，貨號ml026040），HUCMSCs標(biāo)志物檢測試劑盒（美國BD公司，貨號562245），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司，貨號10091155），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司，貨號10565042）。生物潔凈安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號BHC-1300ⅡA/B2），臺式低速離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號5702R），多功能酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號分別為TC20、Gel Doc XR+），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號311），流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號CNL17-A0009），倒置顯微鏡（德國Leica公司，型號DMI3000B），電子天平（德國Sartorious公司，型號CP2251）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離與鑒定

HUCMSCs取自正常分娩產(chǎn)婦，采用傳統(tǒng)貼壁法，嚴(yán)格按照無菌操作分離HUCMSCs[7]：將臍帶剪成0.5～0.8 cm，置于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 d，換液去除漂浮組織，待貼壁細(xì)胞≥80%時開始傳代，傳至第3代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選取第5代細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入流式管中，加入熒光染料標(biāo)記細(xì)胞，常溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD90、CD105、CD73、CD44，鑒定HUCMSCs表型。

2.2 成脂誘導(dǎo)分化能力和成骨誘導(dǎo)分化能力檢測

取對數(shù)期HUCMSCs，按3×105個/孔接種至6孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基（DMEM/F12＋10%FBS），待細(xì)胞生長至60%～70%時，更換成2 mL成脂/成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每隔3 d換新鮮的成脂/成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)3周后，4%多聚甲醛室溫固定，加入油紅O/茜素紅染料染色[8]，顯微鏡下觀察有無脂肪小滴或鈣結(jié)節(jié)。

2.3 藥物血清制備

將20只大鼠隨機(jī)分為藥物血清組和空白血清組，每組10只。根據(jù)人與大鼠體表面積計(jì)算給藥劑量，藥物血清組灌胃2.52 g/kg扶正化瘀方溶液，2次/d，連續(xù)3 d。末次灌胃后1 h行腹主動脈采血，室溫靜置2 h，3 000 r /min離心15 min，吸取血清，0.22 μm濾膜過濾除菌，56 ℃孵育30 min滅活，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取第5代HUCMSCs，以1×103個/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為空白血清組和5%、10%、15%藥物血清組，每組5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)過夜后，空白血清組加入15%空白血清，5%藥物血清組加入5%藥物血清和10%空白血清，10%藥物血清組加入10%藥物血清和5%空白血清，15%藥物血清組加入15%藥物血清，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測各孔吸光度（OD值）。

2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞懸液以1×103個/孔接種至6孔板，分別加入相應(yīng)血清培養(yǎng)14 d，多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，觀察克隆形成數(shù)量。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將HUCMSCs以3×105個/孔接種至6孔板，分別加入相應(yīng)血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞鋪滿6孔板，用10 μL槍頭借助直尺進(jìn)行快速劃痕。PBS洗滌細(xì)胞3次，加入無血清培養(yǎng)基[9]培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并獲取圖像，Image J軟件分析劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）＝實(shí)驗(yàn)后劃痕寬度÷實(shí)驗(yàn)前劃痕寬度×100%。

2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

HUCMSCs分別用不同血清培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×104個細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至Tranwell小室上室；將含20%FBS的培養(yǎng)基加入Tranwell小室下室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[10]。多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)目。

2.8 ELISA檢測細(xì)胞旁分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子能力

將HUCMSCs以3×105個/孔接種至6孔板，加入不同血清培養(yǎng)24、48 h，收集細(xì)胞上清液，加入96孔板中，每孔加入酶標(biāo)試劑0.1 mL，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌5次，37 ℃避光顯色，酶標(biāo)儀波長450 nm處測量各孔OD值。以空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞上清液中bFGF含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表型鑒定

臍帶培養(yǎng)24 h后可見少量貼壁細(xì)胞，72 h全換液后，貼壁細(xì)胞明顯增多；細(xì)胞傳至第5代時，呈短梭形、紡錘形貼壁細(xì)胞逐漸增多（見圖1），局部可形成小的集落，即HUCMSCs克隆。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析HUCMSCs表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示，HUCMSCs高表達(dá)標(biāo)志物CD90（99.8%）、CD105（97.1%）、CD73（99.9%）、CD44（100%），符合HUCMSCs表型特征。

圖1 第5代HUCMSCs形態(tài)（×200）

4.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力鑒定

成脂誘導(dǎo)分化3周后，油紅O染色顯示，細(xì)胞胞質(zhì)中脂滴被染成橘紅色。成骨誘導(dǎo)分化3周后，茜素紅染色顯示，細(xì)胞內(nèi)鈣質(zhì)沉淀被染成紅色，表明HUCMSCs具有多向分化潛能。見圖2。

圖2 HUCMSCs成脂成骨分化鑒定（×200）

4.3 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，5%、10%、15%藥物血清培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h能促進(jìn)HUCMSCs增殖（＜0.05，＜0.01），見表1?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增加，見圖3。

表1 各組HUCMSCs不同時點(diǎn)增殖能力比較（±s，OD值）

注：與同一時點(diǎn)空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖3 各組HUCMSCs克隆形成數(shù)量比較

4.4 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組細(xì)胞遷移率明顯升高（＜0.01），其中，10%、15%藥物血清促進(jìn)HUCMSCs遷移作用更明顯（＜0.01），見圖4、表2。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組遷移細(xì)胞數(shù)目顯著增加（＜0.01），且隨藥物血清濃度增加，遷移細(xì)胞數(shù)目增加（＜0.01），見圖5、表3。

圖4 各組HUCMSCs遷移能力比較（劃痕實(shí)驗(yàn)，×100）

表2 各組HUCMSCs劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移率比較（±s，%）

注：與空白血清組比較，**＜0.01；與5%藥物血清組比較，##＜0.01

圖5 各組HUCMSCs遷移能力比較（Transwell實(shí)驗(yàn)，×40）

表3 各組HUCMSCs Transwell實(shí)驗(yàn)遷移細(xì)胞數(shù)目比較（±s，個）

注：與空白血清組比較，**＜0.01；與5%藥物血清組比較，##＜0.01

4.5 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子能力的影響

與同一時點(diǎn)空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs旁分泌bFGF能力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見表4。

表4 各組HUCMSCs旁分泌bFGF能力比較（±s，pg/mL）

注：與同一時點(diǎn)空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

5 討論

作為間質(zhì)干細(xì)胞的異質(zhì)性亞群，HUCMSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性，可遷移至受損肝組織與肝細(xì)胞融合，或轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，發(fā)揮對肝纖維化的治療作用，并可通過旁分泌作用分泌可溶性因子，改善纖維化瘢痕區(qū)域的微環(huán)境，延緩纖維化進(jìn)程[4，11-12]。但HUCMSCs臨床應(yīng)用存在的問題限制了其發(fā)展，如HUCMSCs在體外誘導(dǎo)增殖時增殖率較低，隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變其自我更新能力逐漸喪失，導(dǎo)致體外培養(yǎng)的HUCMSCs失去部分生物學(xué)功能。另外，干細(xì)胞在治療肝臟疾病時，存在歸巢于肝臟能力低等問題。

肝纖維化屬中醫(yī)學(xué)“肝積”范疇，《金匱要略》有“虛勞之人，陰陽傷損，血?dú)饽凉?，不能宣通?jīng)絡(luò)，故積聚于內(nèi)也”的記載?；谄洹梆鲅獌?nèi)結(jié)、正氣虛弱”的病機(jī)，上海中醫(yī)藥大學(xué)總結(jié)出治療肝硬化的臨床經(jīng)驗(yàn)方扶正化瘀方，該方由冬蟲夏草菌絲、桃仁、丹參、絞股藍(lán)、五味子、松花粉組成，以具有活血化瘀作用丹參作為君藥；桃仁助丹參活血化瘀，冬蟲夏草益精氣補(bǔ)虛勞共為臣藥；松花粉、絞股藍(lán)益氣健脾同為佐藥；五味子味酸，作為使藥引經(jīng)入肝。丹參主要成分丹酚酸B可促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡率[13]。桃仁可減輕血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[14]。冬蟲夏草菌絲可上調(diào)解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)，下調(diào)腫瘤壞死因子-α表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用[15]。絞股藍(lán)主要成分絞股藍(lán)皂苷可阻斷AGEs-RAGE氧化應(yīng)激信號通路，通過降低細(xì)胞上清液丙二醛水平、增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[16]。

扶正化瘀方在緩解臨床癥狀、改善肝纖維化程度及并發(fā)癥等方面療效顯著[11]。同時，可抑制肝星狀細(xì)胞活化及增殖，減輕肝組織脂肪變、炎癥及纖維化程度，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及肝細(xì)胞損傷，改善肝臟微循環(huán)及肝組織缺氧狀態(tài)；也可通過抑制Kupffer細(xì)胞表達(dá)VEGF，阻止新生血管形成，促進(jìn)肝竇毛細(xì)血管化逆轉(zhuǎn)[17-19]。本研究進(jìn)一步探討了扶正化瘀方藥物血清對HUCMSCs增殖、遷移及旁分泌能力的影響，結(jié)果表明，扶正化瘀方藥物血清可提高HUCMSCs體外增殖、遷移及旁分泌bFGF能力。bFGF作為一種多肽分子，可促進(jìn)HUCMSCs生長，且經(jīng)bFGF處理的HUCMSCs在改善肝損傷程度及肝纖維化方面效果更顯著[20]。以上研究結(jié)果可為扶正化瘀方結(jié)合干細(xì)胞治療肝臟疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects ofDecoction Contained Serum on Proliferation, Migration and Parapocrine Capacity of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

LUAN Yuling1, HUA Dongming1, CHEN Xiangbo2, WANG Fang1, KONG Xiaoni1, FENG Yu1

To investigate the effects ofDecoction contained serum on the proliferation, migration and paracocrine ability of human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs).HUCMSCs were isolated by adherence method. The phenotype and the differentiation ability of HUCMSCs were examined by flow cytometry. The fifth generation of HUCMSCs were randomly divided into blank serum group, 5%, 10% and 15% drug-contained serum group, CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of HUCMSCs. The proliferation ability of HUCMSCs was detected by clone formation experiment. The migration ability of HUCMSCs cells was detected by scratch adhesion test. Transwell assay was used to detect the migration ability of HUCMSCs. The ability of HUCMSCs to paracrine bFGF was detected by ELISA.The high expression markers of CD90 (99.8%), CD105 (97.1%), CD73 (99.9%) and CD44 (100%) in isolated and cultured HUCMSCs were consistent with the phenotypes of mesenchymal stem cells and had the ability of osteogenic and adipogenic differentiation. CCK-8 results showed that 5%, 10% and 15% drug-contained serum could promote the proliferation of HUCMSCs (<0.05). The clone formation experiment showed that, compared with the control group, the number of cell clone formation significantly increased in the 5%, 10% and 15% drug-contained serum groups. Scratch adhesion test and Transwell assay results showed that, compared with the control group, the migration rate of HUCMSCs cells in 5%, 10% and 15% drug-contained serum groups significantly increased (<0.01), and the cell migration rate showed increased trend with the increased drug-contained serum. The ELISA result showed that, compared with the control group at the same period, the ability of HUCMSCs to paracrine bFGF in 5%, 10% and 15% drug-contained serum group increased (<0.05).Decoction contained serum can significantly promote the abilities of proliferation, migration and paracrine bFGF of HUCMSCs.

Decoction; human umbilical cord mesenchymal stem cells; cell proliferation; cell migration; paracrine ability

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0056-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104350

國家自然科學(xué)基金（81873582）；上海中醫(yī)藥大學(xué)“研究生創(chuàng)新培養(yǎng)”專項(xiàng)科研項(xiàng)目（3489）

馮煜，E-mail：davisfy@126.com

（2021-04-19）

（修回日期：2021-05-02；編輯：鄭宏）