黃芪甲苷通過抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡緩解糖尿病雌鼠生殖損傷

任雪華，文 揚(yáng)，虞 蓮，田佳卉，雷安民*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，全球有超過6%的人口受到影響[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告，2019年全世界估計(jì)有4.63億成年人患有糖尿病，預(yù)計(jì)2045年將上升到7億。糖尿病患者體內(nèi)高水平的血糖會(huì)對各種器官的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生有害影響[2-3]。高血糖導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen specie，ROS)的過量產(chǎn)生會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激進(jìn)而對組織造成損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病對女性卵巢功能的影響主要包括初潮延遲，多囊卵巢綜合征，月經(jīng)不調(diào)，無排卵和更年期提前以及卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[4]。另外，越來越多的動(dòng)物模型表明，糖尿病會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常再分配，線粒體功能障礙，減數(shù)分裂裝置解體，透明帶厚度減小以及卵母細(xì)胞的表觀遺傳變化等問題[5-7]，從而表現(xiàn)出糖尿病小鼠卵巢儲(chǔ)備下降[8]，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和早期胚胎發(fā)育受損[9]。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)是提取自黃芪的三萜皂苷類單體成分，是黃芪主要的有效成分。藥理學(xué)研究顯示，黃芪甲苷具有降血糖、保護(hù)肝臟、充當(dāng)利尿劑、并具有抗氧化、抗衰老、抗壓力、抗高血壓和廣泛的抗菌性能[10-11]。藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，小鼠在服用黃芪甲苷后，可以在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為環(huán)黃芪醇[12]，環(huán)黃芪醇在體外被證明擁有抗氧化功能并且能激活端粒酶保護(hù)端粒[13-14]，而端粒長度與細(xì)胞增殖能力成正比，即端粒酶的激活可以增加細(xì)胞的增殖能力，抵抗細(xì)胞的凋亡[15]。

本研究通過使用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)制造1型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)模型小鼠，并按每次50 mg/kg對小鼠進(jìn)行黃芪甲苷灌胃，每天2次，持續(xù)1周[16]。通過統(tǒng)計(jì)比較各組卵母細(xì)胞體內(nèi)外發(fā)育情況、卵巢組織結(jié)構(gòu)來探究灌胃黃芪甲苷對1型糖尿病雌鼠生殖系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡～8 周齡ICR系雌性小鼠，購自維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑 黃芪甲苷、鏈脲佐菌素，麥克林公司產(chǎn)品；Milrinone、M2培養(yǎng)基、TritonX-100、PBS、蘇木精、伊紅、礦物油、檸檬酸鈉、檸檬酸，Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；免疫熒光染色封閉液、免疫熒光染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液、免疫熒光染色抗熒光淬滅劑、α-Tubulin抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、Tunel凋亡檢測試劑盒、DAPI，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；人絨毛膜促性腺激素(hCG，180428)、孕馬血清(PMSG，120727)，寧波三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 血糖儀(GA-3)、一次性使用末梢采血針，三諾生物傳感股份有限公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thremo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；體式顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；熒光相差倒置顯微鏡、恒溫加熱臺，Leica公司產(chǎn)品；電子天平，Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雌性TID模型鼠制備 購買6周齡～8周齡體重在25 g以上的ICR雌鼠進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，藥物注射前隔夜禁食。將STZ用0.1 mol/L pH為4.2的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖溶液溶解，并按照每只230 mg/kg進(jìn)行腹腔注射。給與充分的飼料與凈水飼養(yǎng)3 d。3 d后空腹一晚，次日尾靜脈采血并用血糖儀檢測血糖，血糖值高于17 mmol/L的小鼠可以被認(rèn)定為造模成功。對于造模不成功的小鼠，可按STZ 100 mg/kg再次腹腔注射造模。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與藥物灌胃 將造模成功小鼠隨機(jī)分成模型組(TID)和治療組(TID+AS-Ⅳ)，每組20只小鼠，另取20健康ICR雌性小鼠作為對照組。將黃芪甲苷用生理鹽水配制成3.75 mg/mL的灌胃液，4 ℃保存，使用前室溫平衡。每日早晚2次灌胃給藥，空白對照組不進(jìn)行灌胃，模型組灌胃等量生理鹽水，治療組按體重50 mg/kg灌胃黃芪甲苷溶液，持續(xù)1周。

1.2.3 卵母細(xì)胞收集與培養(yǎng) 采集GV期卵母細(xì)胞前44 h～46 h 按10 IU/只劑量對小鼠腹腔注射PMSG超數(shù)排卵。頸部脫臼處死小鼠取出卵巢，在體式顯微鏡下，用小鑷子固定卵巢，通過1 mL注射器針頭撕破卵巢上的卵泡，待卵巢上所有卵泡均被撕破后，用撿卵針迅速將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes,COCs)移入含有2.5 μmol/L Milrinone的M2培養(yǎng)基中放入培養(yǎng)箱，4 h后統(tǒng)計(jì)生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率，12 h后統(tǒng)計(jì)第一極體(polarbody 1,PB1)率。

采集MⅡ卵母細(xì)胞前44 h～46 h按每只10 IU劑量對小鼠腹腔注射PMSG進(jìn)行超數(shù)排卵，12 h～14 h前按每只10 IU劑量腹腔注射hCG促進(jìn)卵母細(xì)胞排出。頸部脫臼處死小鼠取出其左右兩側(cè)的輸卵管，在體式顯微鏡下通過1 mL注射器針頭將膨大的輸卵管壺腹部撕破，從而使得卵母細(xì)胞排出，用稍粗的撿卵針迅速將釋放出來的COCs移入M2培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

1.2.4 卵母細(xì)胞免疫熒光 分別收集各組GV期培養(yǎng)12 h后的卵母細(xì)胞，在10 mg/mL的PFA中4 ℃過夜固定；用PBS緩沖液洗滌3次，移入5 mL/L的Triton X-100 中室溫透膜20 min；PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)入免疫熒光封閉液中室溫封閉1 h；PBS洗滌3次，移入一抗(1∶200)中4 ℃孵育過夜；之后將卵母細(xì)胞在PBS中漂洗3次，每次5 min，移入二抗(1∶2 000)中室溫避光孵育2 h；PBS漂洗3次，每次5 min，隨后將卵母細(xì)胞移入Hoechst 33342中室溫避光孵育5 min；PBS漂洗3次，每次5 min，將卵母細(xì)胞移入用凡士林劃線并具有抗熒光淬滅劑的載玻片小格中，封片，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 卵巢石蠟切片制作與HE染色 小鼠斷頸處死后，取出卵巢，PBS清洗，投入40 mg/mL的PFA中，過夜固定。將固定好的卵巢梯度脫水。隨后將卵巢用二甲苯透明處理。處理好的卵巢在60 ℃烘箱中浸蠟，并調(diào)整好卵巢位置進(jìn)行包埋。包埋好的蠟塊在超薄切片機(jī)上切片，厚度一般為 5 μm～7 μm。將切好的切片在45 ℃預(yù)熱的展片機(jī)上展片，待展開后用黏附載玻片撈取切片，并在顯微鏡下鏡檢，挑選形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的切片并用鉛筆在載玻片上相應(yīng)位置標(biāo)記，并進(jìn)行脫蠟與復(fù)水，將復(fù)水后的切片用蘇木精處理8 min，自來水浸泡藍(lán)化20 min，伊紅染液3 min，隨后脫水。染完的切片用樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

1.2.6 卵巢切片Tunel凋亡檢測 在脫蠟與復(fù)水的切片上滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，置于濕盒中 37 ℃作用30 min。在避光環(huán)境下，向組織上滴加50 μL 配制好的Tunel反應(yīng)液，于濕盒中37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長范圍為450 nm～500 nm，發(fā)射波長范圍為515 nm～565 nm(綠色熒光)。

1.2.7 活性氧(ROS)檢測 用卵母細(xì)胞體外操作液MEM稀釋DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L，將培養(yǎng)的卵母細(xì)胞移入此檢測液中清洗3遍，并移入新的檢測液中，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育20 min，隨后用PBS清洗卵母細(xì)胞3遍后，將卵母細(xì)胞移入帶有抗熒光猝滅劑并用凡士林劃好小格的切片中，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察。熒光強(qiáng)度的灰度值分析用Image J進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)統(tǒng)計(jì)至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)是由一個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)在不同的時(shí)間完成。熒光強(qiáng)度用Image J進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

T1D模型小鼠制備與藥物處理時(shí)間如圖1所示。對成功建模的模型小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，收集各組各時(shí)期的卵母細(xì)胞，其卵母細(xì)胞形態(tài)以及各個(gè)階段卵母細(xì)胞數(shù)量如圖2所示。T1D雌性小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞在形態(tài)上與正常卵母細(xì)胞相比有明顯的差距，其胞質(zhì)碎片增多，并且透明帶形態(tài)也不完整(圖2A)。在使用黃芪甲苷灌胃后，治療組雌鼠排卵數(shù)相較模型組T1D雌鼠有了大的提升，每只12.6枚±1.7枚，顯著高于模型組每只1.6枚±1.2枚(P<0.05)，并且卵母細(xì)胞形態(tài)接近于對照組雌鼠。同時(shí)發(fā)現(xiàn)灌胃黃芪甲苷也可以提高T1D雌鼠GV期卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力，治療組GVBD率為32.9±5.9、PB1率為13±4.1，均高于模型組GVBD率(13±2.3)、PB1率(0.8±0.79)(P<0.05)(圖2B、圖2C、圖2D)。這說明黃芪甲苷處理可以挽救T1D雌性小鼠的生殖潛力，幫助其改善高血糖對卵巢的損傷，恢復(fù)卵巢一定的功能。

圖1 模型小鼠藥物處理示意圖

2.2 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵母細(xì)胞紡錘體及ROS水平的影響

為了進(jìn)一步探究黃芪甲苷改善T1D雌鼠生殖潛力的機(jī)理，將各組收集的GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)12 h，通過DAPI與Tubulin免疫熒光染色觀察各個(gè)組的紡錘體形成情況。如圖3A所示，對于T1D組，其紡錘體形成似乎受到了抑制，這可能是T1D組體外發(fā)育過程中沒有卵母細(xì)胞發(fā)育到MⅡ期的原因。但對于黃芪甲苷處理組，雖然成功形成了紡錘體，但其紡錘體形態(tài)相較于正常組更為短小，而且染色體排列也不均勻。同時(shí)，收集了GV、GVBD、PB1三個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞，并對其進(jìn)行了ROS染色，結(jié)果如圖3B所示。通過量化熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)模型組GV期卵母細(xì)胞的ROS含量高于其他組，而后熒光強(qiáng)度快速下降；治療組的ROS水平在GVBD期較GV期上升，且高于其他2組，在PB1時(shí)期又下降；而對照組的ROS水平從GV期開始上升，在PB1期高于其他2組。這說明T1D雌鼠與正常小鼠卵母細(xì)胞ROS的變化規(guī)律不同，而黃芪甲苷可以改變這種差異。由于細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與線粒體活性相關(guān)這可能在暗示T1D會(huì)使得卵母細(xì)胞中線粒體提前進(jìn)入激活狀態(tài)，而黃芪甲苷則會(huì)推遲T1D的這種作用。由于在卵母細(xì)胞成熟過程中，第一次減數(shù)分裂阻滯依賴于顆粒細(xì)胞cGMP進(jìn)入卵母細(xì)胞[17]。因此，推測這種異常的激活可能與顆粒細(xì)胞相關(guān)。

A.MⅡ期卵母細(xì)胞形態(tài)；B.MⅡ期卵母細(xì)胞數(shù)量；C.PB1率；D.GVBD率。比例尺100 μm。*(P<0.05)，**(P<0.01)

A.體外培養(yǎng)12h后，各組卵母細(xì)胞Tubulin與DAPI染色；B.各組卵母細(xì)胞各個(gè)階段DCFH-DA染色；C.各組DCFH-DA染色后熒光強(qiáng)度。比例尺100 μm

2.3 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵巢結(jié)構(gòu)的影響

為了驗(yàn)證前面所提出的是顆粒細(xì)胞異常導(dǎo)致卵母細(xì)胞異常激活，從而引發(fā)T1D雌鼠生殖缺陷的推測，采集了3組雌鼠的卵巢并通過HE染色與凋亡染色進(jìn)行了探究，結(jié)果如圖4所示。從圖4A～圖4C可以發(fā)現(xiàn)，對于T1D雌鼠卵巢而言，幾乎沒有格拉夫氏卵泡與黃體。這與前面模型組MⅡ期排卵數(shù)數(shù)據(jù)顯示的結(jié)果一致，模型組雌鼠幾乎不排卵。通過進(jìn)一步觀察卵巢上的顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)如圖4E所示，對于T1D雌鼠，卵泡中卵母細(xì)胞上的顆粒細(xì)胞層數(shù)要明顯少于對照組D和治療組F。由于高糖介導(dǎo)細(xì)胞凋亡已有眾多的報(bào)道，據(jù)此我們推測這種顆粒細(xì)胞層數(shù)的減少可能與顆粒細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)，為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們對卵巢組織進(jìn)行了Tunel凋亡染色，如圖4G～圖4J所示，通過Tunel凋亡染色,發(fā)現(xiàn)T1D雌鼠卵巢中顆粒細(xì)胞異常凋亡卵泡所占比例遠(yuǎn)高于對照組G和治療組I。

A～F.卵巢切片的HE染色圖；G～I(xiàn).卵巢切片的Tunel染色圖；J.各組凋亡卵泡數(shù)與總卵泡數(shù)比值。A、B、C比例尺為1 mm；D、E、F比例尺為100 μm；G、H、I比例尺為50 μm。**(P<0.01)

3 討論

在前人對糖尿病導(dǎo)致卵母細(xì)胞損傷的研究中，發(fā)現(xiàn)對于糖尿病小鼠而言，其排卵數(shù)量明顯較少，卵母細(xì)胞ROS含量上升，表觀遺傳發(fā)生改變，后續(xù)發(fā)育潛力受損[18]，在本研究也重現(xiàn)了這一點(diǎn)。有趣的是在對T1D雌鼠卵母細(xì)胞抑制過程的研究中，發(fā)現(xiàn)對于T1D雌鼠卵母細(xì)胞，其極易被阻滯在GV期，并且細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)了明顯不統(tǒng)一的發(fā)育節(jié)奏，這可能是其卵母細(xì)胞發(fā)育不良的重要原因。另外，高血糖使得細(xì)胞內(nèi)ROS的上升[19]，如圖3B所示，T1D雌鼠的GV期卵母細(xì)胞相較于對照組與黃芪甲苷治療組其在GV期時(shí)就表現(xiàn)出高的ROS水平，而正常組卵母細(xì)胞ROS水平要到PB1之后才有明顯升高，這說明對于T1D雌鼠而言，其胞質(zhì)內(nèi)的線粒體在其啟動(dòng)減數(shù)分裂以前就已充分激活。在關(guān)于ROS與細(xì)胞周期的研究中，人們發(fā)現(xiàn)ROS會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)一些關(guān)鍵性的蛋白如MAPKS異常的磷酸化，而這些蛋白的磷酸化會(huì)使得一些細(xì)胞內(nèi)通路的異常開啟或者關(guān)閉，從而引發(fā)細(xì)胞周期的紊亂等，如MAPK通路的持續(xù)激活就可以使得停滯在G1期[20]。此外，ROS含量與DNA損傷也息息相關(guān)，端粒DNA被認(rèn)為特別容易受到ROS介導(dǎo)的切割和堿基修飾的影響[21]，從而造成DNA損傷進(jìn)而激活了p53蛋白的活性，上調(diào)周期激酶抑制劑p21蛋白的水平或者凋亡通路蛋白水平，最終導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯甚至細(xì)胞凋亡。顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中也發(fā)揮著重大作用，顆粒細(xì)胞中的cGMP能夠進(jìn)入卵母細(xì)胞抑制cAMP-磷酸二酯酶活性，維持cAMP濃度，并使細(xì)胞質(zhì)成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor,MPF)處于非活化態(tài)，維持減數(shù)分裂阻滯，在T1D雌鼠中我們觀察到其卵泡中的顆粒細(xì)胞凋亡比例要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組，因此這種T1D雌鼠的提前激活也可能是由于其顆粒細(xì)胞過度凋亡而引起的。采用黃芪甲苷治療T1D雌鼠，可以發(fā)現(xiàn)對比模型組，治療組在GV期的ROS含量雖然比正常組要稍微高一點(diǎn)，但是卻比模型組要低，提示黃芪甲苷可以通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的積累從而減少ROS對細(xì)胞周期的影響。且黃芪甲苷灌胃之后卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡明顯較少，這也助于抑制因顆粒細(xì)胞凋亡引發(fā)的卵母細(xì)胞激活。除此之外，黃芪甲苷的體內(nèi)代謝物環(huán)黃芪醇是目前已知的一種端粒酶激活劑，其可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中激活端粒酶從而修復(fù)因細(xì)胞分裂或者外部影響導(dǎo)致的端粒變短與受損[22]。據(jù)此推測環(huán)黃芪醇在這個(gè)過程中可能也起到了一定的作用。

在本研究中，通過鏈脲佐菌素建立T1D雌鼠模型，并對模型小鼠進(jìn)行黃芪甲苷灌胃，研究黃芪甲苷對T1D雌鼠生殖系統(tǒng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以抵抗T1D對小鼠卵巢造成的損傷，但是并不能完全的逆轉(zhuǎn)，其可能是通過幫助顆粒細(xì)胞抵抗凋亡而實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)研究黃芪甲苷對糖尿病小鼠雌性生殖系統(tǒng)的影響，一方面能為臨床上應(yīng)用黃芪甲苷治療糖尿病奠定基礎(chǔ)，另一方面也為黃芪甲苷對糖尿病的治療效果以及作用機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)。