轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子DeoT對大腸埃希氏菌多重耐藥性的影響

劉洪蕾，甄思慧，王家偉，程如楠，岳 亮，王 真

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

抗菌藥物在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的濫用導(dǎo)致了耐藥菌及耐藥基因(ARGs)的出現(xiàn)，并可在全球環(huán)境中檢測到抗菌藥物。尤其值得關(guān)注持續(xù)出現(xiàn)的“超級細(xì)菌”和無法治療的感染的現(xiàn)象。大腸埃希氏菌是人類和動物中最常見的革蘭氏陰性細(xì)菌?？顾幮源竽c埃希氏菌的感染在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。根據(jù)國家衛(wèi)生與健康委員會細(xì)菌耐藥性調(diào)查網(wǎng)(Mohnarin)2015年公布的官方數(shù)據(jù)，大腸埃希氏菌的耐藥性排名最高[1]。近年來，由于大腸埃希氏菌抗菌藥物耐藥性的出現(xiàn)速度過快，缺乏針對高耐藥菌株的治療藥物，使抗菌藥物耐藥和大腸埃希氏菌感染問題受到了廣泛關(guān)注。此外，由于大腸埃希氏菌容易發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，常被認(rèn)為是抗菌藥物耐藥性傳播的載體[2]。長期以來細(xì)菌耐藥性的傳播促使人們通過各種方法尋找新的抗菌藥物，如改變現(xiàn)有的抗菌藥物，通過篩選化學(xué)藥品[3-4]或肽庫[5-6]以尋找特定的抑制劑，或靶向新的蛋白質(zhì)并研究其作用[7-8]。近年研究還涉及通過基因組學(xué)檢測新的靶點(diǎn)[9]，利用生物信息學(xué)篩選肽類抗菌劑，以及通過宏基因組學(xué)尋找抗菌藥物新來源[10]。

早期對相關(guān)耐藥基因的篩選研究表明，大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)座子插入deoT基因(一種DeoR家族的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子DeoT的基因)會增加抗菌藥物的敏感性。DeoR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族的成員存在于多種革蘭氏陽性菌和陰性菌中[11]。據(jù)報道，DeoT作為一種調(diào)節(jié)因子還能影響其他不同調(diào)節(jié)子的多個無關(guān)基因的表達(dá)[11]。DeoR1被證明參與了布魯氏菌virB基因轉(zhuǎn)錄的激活[12]。此外，DeoT抑制參與不同代謝途徑的基因表達(dá)，包括糖的運(yùn)輸、肽的降解和脂肪酸的分解；還可能與細(xì)胞對環(huán)境變化的反應(yīng)有關(guān)[11]。正如在大腸埃希氏菌對滲透壓上調(diào)的早期反應(yīng)中觀察到的一樣[13]，DeoT抑制基因的方式可能反映了代謝途徑的普遍下調(diào)，從而導(dǎo)致短暫的生長停滯。除上述報道外，DeoT是否參與了大腸埃希氏菌耐藥基因的調(diào)控尚不清楚。

為了進(jìn)一步了解DeoT對大腸埃希氏菌基因表達(dá)的調(diào)控作用，并證實(shí)DeoT對大腸埃希氏菌耐藥性的影響，本研究構(gòu)建了deoT基因缺失株，對其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序分析，并通過熒光定量PCR(real-time PCR)對deoT調(diào)控靶向基因作用進(jìn)行了確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用的大腸埃希氏菌E8親本株為本實(shí)驗(yàn)室從河北省1頭腹瀉犢牛中分離得到的。藥敏試驗(yàn)證實(shí)，該分離菌株E8對多種藥物具有耐藥性，尤其是對氨基糖苷類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。所有菌株在添加或不添加氨芐青霉素(100 mg/L)和氯霉素(30 mg/L)LB中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑及儀器 細(xì)菌RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；Agilent 2100生物分析儀，北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1deoT基因缺失突變體及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建 為構(gòu)建deoT基因缺失株，如文獻(xiàn)所述進(jìn)行基因消除[14]。引物如下：deoT-F(AGAGCGGATGATTTGTCAAACTGCAAATCATCCCGTAGAGAAGGGAAATGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG),deoT-R(CGCGTCAGTATTTTTTTATTTAGTATTATAACGTTATAAGAATTACAGCGCATATGAATATCCTCCTTAG)。為構(gòu)建E8ΔdeoT的基因互補(bǔ)株，將deoT片段擴(kuò)增后連接到質(zhì)粒pBBR1MCS中。將得到的重組載體pBBRdeoT電穿孔到E8ΔdeoT中，命名為E8CdeoT。

1.2.2 抗菌藥物最小抑菌濃度測定 最小抑菌濃度(MIC)是指抑制細(xì)菌生長的抗菌藥物所需最低濃度。為探究deoT對大腸埃希氏菌抗菌藥物的敏感性，篩選出四環(huán)素、萬古霉素、新霉素、氨芐青霉素、青霉素、諾氟沙星、大觀霉素、頭孢唑肟、慶大霉素、萘啶酸等10種抗菌藥物。將菌株用LB培養(yǎng)基在37 ℃中培養(yǎng)過夜，調(diào)整活菌到106CFU/mL。在試管中用MH培養(yǎng)基分別將每種抗菌藥物從2 048 μg/mL進(jìn)行2倍稀釋。隨后，將1 mL細(xì)菌懸液分別加入到每種抗菌藥物的不同濃度試管，充分混勻后在37 ℃下培養(yǎng)16 h～18 h。重復(fù)3組。

1.2.3 RNA的提取和測序 將菌株E8和E8ΔdeoT的單個菌落用LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h。用細(xì)菌RNA提取試劑盒分離每個樣品的總RNA。使用2100生物分析儀驗(yàn)證RNA質(zhì)量，通過無RNA酶瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的RNA樣本用于cDNA文庫的構(gòu)建。cDNA文庫在Illumina測序平臺 (Illumina HiSeq 2000，Illumina，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國)上使用配對末端技術(shù)進(jìn)行測序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析 以大腸埃希氏菌O157：H7基因組為參考序列，通過SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和sickle (https://github.com/najoshi/sickle)去除適配序列、低質(zhì)量讀數(shù)(Q值<20)、不明確的核苷酸“N”和長度小于20 bp的片段序列。以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR<0.05)和log2FC≥2作為閾值來判斷基因表達(dá)差異顯著性。用GO[15]和KEGG[16]對差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和分類。

1.2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq的結(jié)果，對5個顯著上調(diào)和5個顯著下調(diào)的基因進(jìn)行RT-qPCR。每個基因擴(kuò)增用引物見表1。按照上述方法分離總RNA，然后根據(jù)(賽默飛世爾科技有限公司)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用Power SYBR Green PCR系統(tǒng)將1 μL所得cDNA進(jìn)行qPCR。檢測基因的正、反引物如表1所示，用16S rRNA基因?qū)λ兄颠M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用2-△Ct方法計算相對表達(dá)水平[17]，使用所有基因的平均Ct值進(jìn)行分析以校正cDNA輸入的差異。

表1 RT-qPCR擴(kuò)增所用引物

2 結(jié)果

2.1 突變株E8ΔdeoT對抗菌藥物的耐藥性

各菌株對抗菌藥物的MIC測定結(jié)果如表2所示，E8ΔdeoT對四環(huán)素(4倍)、萬古霉素(4倍)、萘啶酸(4倍)、氨芐青霉素(2倍)、大觀霉素(2倍)和青霉素(4倍)的敏感性高于親本菌株E8和互補(bǔ)菌株E8CdeoT。表明DeoT編碼基因的缺失影響了大腸埃希氏菌E8株固有的多重耐藥性。

表2 大腸埃希氏菌株的藥物敏感性

2.2 DeoT對大腸埃希氏菌基因的表達(dá)調(diào)控

為了解deoT基因的功能，使用RNA-seq分析法測定了deoT缺失株基因的轉(zhuǎn)錄組。從E8和E8ΔdeoT的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中分別獲得15234336和17645316個序列。將測序序列與大腸埃希氏菌O157:H7的基因組匹配。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)E8ΔdeoT與E8的差異表達(dá)基因共有118個，其中有76個基因表達(dá)下調(diào)，42個基因表達(dá)上調(diào)。

2.3 E8ΔdeoT差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

E8ΔdeoT差異表達(dá)基因的功能分類結(jié)果如圖1所示，所有與調(diào)節(jié)生物過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和受體活性相關(guān)的基因均上調(diào)；與生物黏附、細(xì)胞成分組織或生物轉(zhuǎn)化、抗氧化活性和電子載體活性相關(guān)的基因均下調(diào)。除這些功能分類外，所有其他類別均包括上調(diào)和下調(diào)基因。在與細(xì)胞代謝、單個生物過程、細(xì)胞或細(xì)胞成分和催化活性相關(guān)的基因中，下調(diào)基因的數(shù)量與上調(diào)基因的數(shù)量相似。KEGG分析表明，差異表達(dá)基因涉及代謝途徑，包括各種氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)和能量代謝等多個途徑。此外，還有多個基因涉及細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、雙組分系統(tǒng)和細(xì)菌趨化途徑等。并且這些途徑可能直接或間接地與大腸埃希氏菌耐藥性有關(guān)。

圖1 差異基因表達(dá)

2.4 DeoT對ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)/膜蛋白的調(diào)控

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過參與化學(xué)物質(zhì)的吸收、分布和消除來影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，29個與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜蛋白相關(guān)的基因在E8ΔdeoT中差異表達(dá)。如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因malE、dcuB、malK和mglB在E8ΔdeoT中的表達(dá)顯著降低。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/膜蛋白編碼基因，如tdcC、srlB、nanT、malG、rbsB、ompT、yeeE、fimD和galP下調(diào)，exbB、feoA、feoB、feoC、cysU、cysP、cysA、cysW和ydhC在E8ΔdeoT中顯著上調(diào)。研究報道發(fā)現(xiàn)由exbB編碼的生物聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ExbB是幽門螺旋桿菌的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)[18]。一種在極端變性條件下具有活性的外膜蛋白酶OmpT能夠提高大腸埃希氏菌對正丁醇的耐受性[19]。 參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的FeoA也被發(fā)現(xiàn)顯著提高了對正丁醇-丁醇的抵抗力[19]。參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在E8ΔdeoT中上調(diào)，表明鐵轉(zhuǎn)運(yùn)途徑受到破壞。

2.5 DeoT對新陳代謝的調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄組分析表明，許多與代謝相關(guān)的基因在E8ΔdeoT中有差異表達(dá)，如fumB、aceE、aceF、sucB、sucD、mdh、pckA、sdhB、pflD、ttuC、gapA、yiaY、tdcD、garR、srlB、srlD、nanE、nanA、lacZ、frdD、frdC、frdB等參與碳水化合物代謝。4種frd基因編碼富馬酸還原酶復(fù)合物的亞基，該復(fù)合物轉(zhuǎn)錄組受交替電子受體氧、硝酸鹽和富馬酸的細(xì)胞可用性的調(diào)控。[24]。據(jù)報道，frdD突變可能影響ampC啟動子的強(qiáng)度，誘導(dǎo)ampC的表達(dá)增強(qiáng)，并導(dǎo)致大腸埃希氏菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐受性的增加[20]。從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果來看，frdD在E8ΔdeoT中的表達(dá)下調(diào)。

此外，11個涉及氨基酸代謝的基因包括tnaA、katG、cadA、cysK、cadB、sdaA、cysM、trpGD、trpE、katG、speC和ansA，在E8ΔdeoT中均有差異表達(dá)。例如，cadA和cadB在E8ΔdeoT中表達(dá)顯著上調(diào)；CadA是一種賴氨酸脫羧酶，可將賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺(一種多胺)。所有細(xì)胞類型的正常生長都需要多胺，它可以影響蛋白質(zhì)、DNA和RNA的功能。反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB吸收賴氨酸并排出尸胺，從而消耗質(zhì)子[21]。然而，許多作為二級轉(zhuǎn)運(yùn)器的多藥外排系統(tǒng)是由跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度(ΔμH+)的質(zhì)子動力(PMF)驅(qū)動的，而不是由ATP水解驅(qū)動的[22]。因此，E8ΔdeoT中顯著上調(diào)的cadA和cadB基因?qū)е沦|(zhì)子減少，從而影響多藥外排系統(tǒng)的功能，提高E8ΔdeoT對大多數(shù)抗菌藥物的敏感性。

2.6 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq分析的基因差異表達(dá)模式，選擇顯著差異調(diào)控的基因進(jìn)行了RT-qPCR。在118個差異表達(dá)的基因中，根據(jù)基因功能及其在抗菌藥物耐藥性中的潛在作用選擇了10個基因。如表3所示，RNA-seq和RT-qPCR結(jié)果具有良好的一致性；在E8ΔdeoT中有5個基因下調(diào)，5個基因上調(diào)。由此證實(shí)了RNA-seq和RT-qPCR數(shù)據(jù)之間的強(qiáng)相關(guān)性，以及基因表達(dá)的真實(shí)性。

表3 選擇基因的RT-qPCR結(jié)果

3 討論

DeoT是DeoR家族的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于多種細(xì)菌中。DeoT作為一種廣譜調(diào)節(jié)因子，抑制多種代謝途徑中基因的表達(dá)，包括麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸β-氧化和肽降解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌deoT基因缺失后對常用抗菌藥物的MIC明顯降低，表明DeoT在大腸埃希氏菌耐藥性中起重要作用。

對大腸埃希氏菌親本菌株E8和E8ΔdeoT突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明，在E8ΔdeoT中共鑒定出118個差異表達(dá)基因，其中76個下調(diào)基因和42個上調(diào)基因。其中，E8ΔdeoT的差異表達(dá)基因包括4個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和29個運(yùn)輸/膜蛋白編碼基因。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過參與化學(xué)物質(zhì)的吸收、分布和消除來影響其在細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。多重耐藥(MDR)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動外排抗菌藥物是引起細(xì)菌耐藥的主要途徑，使細(xì)菌感染的臨床治療復(fù)雜化[23]。例如，由exbB編碼的生物聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ExbB被發(fā)現(xiàn)是幽門螺桿菌的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)[18]，且在E8ΔdeoT中出現(xiàn)顯著上調(diào)，極有可能增加了E8ΔdeoT藥物敏感性。

此外，RNA-seq結(jié)果顯示，許多與代謝相關(guān)的基因在E8ΔdeoT中差異表達(dá)；參與氨基酸代謝的cadA和cadB在E8ΔdeoT中顯著上調(diào)。此前已有報道稱，cadA和cadB也可以間接影響多藥外排系統(tǒng)的功能[21]，從而提高E8ΔdeoT對大多數(shù)抗菌藥物的敏感性。

綜上所述，DeoT在大腸埃希氏菌多重耐藥性中起著重要的作用，直接或間接調(diào)控多個基因的表達(dá)。本文為了解DeoT具體調(diào)控的相互作用以及與大腸埃希氏菌耐藥性的關(guān)系提供了重要信息，但仍需要進(jìn)一步的研究來分析DeoT參與的細(xì)菌多重耐藥性調(diào)控機(jī)制。