住院新生兒鼻腔和體表定植金黃色葡萄球菌的分子特征及耐藥性

王 紅 郁 潔 王 博 耿文靜 向希盈 王 青 姚開虎 黑明燕, 3

金黃色葡萄球菌(SA)是體表的常見定植菌，可通過母體或環(huán)境接觸等定植到新生兒。SA定植是指患兒鼻腔、腋下、臍部和腹股溝中任何≥1個部位拭子培養(yǎng)SA陽性，但患兒的臨床癥狀及常規(guī)實驗室檢驗結果均不支持存在細菌感染[1]。SA定植可增加NICU住院患兒發(fā)生SA感染的風險[2,3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NICU住院新生兒在入院3 d內采集鼻前庭拭子標本進行檢測時，SA定植率為17.9%[4]，有報道多部位檢測可增加SA的檢出率[5,6]，多部位定植發(fā)生SA感染的風險高于單部位定植[7]。本研究擬對NICU入院新生兒鼻腔及體表采樣分離SA，分析單部位和多部位SA的定植率及其菌株分子特征和耐藥情況，為制定合理的治療方案提供幫助。

1 方法

1.1 倫理 本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會審核(審編號：2020-Z174)。本研究不對患兒采取額外臨床干預，所有信息采用去身份標識處理，且不收取費用，故免于對家長進行額外的書面知情告知。

1.2 納入標準 前瞻性納入2020年8月1日至2021年1月31日入住我院NICU時，入院日齡≤28 d且胎齡≥28周的新生兒。

1.3 排除標準 符合以下任意1項者排除：①鼻腔畸形或采樣部位皮膚破潰，②新生兒病情不穩(wěn)定(需要應用血管活性藥物維持血壓或需要氣管插管高頻振蕩輔助通氣)，③因外科疾病入院、需手術干預或已在外院接受手術干預者，④入院后至采集標本前沐浴過的患兒。

1.4 標本采集方法 符合本文納入和排除標準的新生兒在入院24 h 內，由專人以生理鹽水濕潤后的無菌棉棒進行拭子采集。鼻前庭：進入鼻腔1 cm，沿著鼻黏膜轉圈5次并停留10～15 s；臍根部：或在臍窩、或在臍帶殘端轉圈擦拭；腋下和腹股溝：拭子來回滾動擦拭10次。

1.5SA培養(yǎng)、分子型鑒定和耐藥測定

1.5.1SA培養(yǎng) 收取標本后立即送至我院兒科研究所細菌室，將拭子接種于含5%羊血的細菌培養(yǎng)基中，用接種環(huán)3區(qū)劃線，置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5.2SA菌落計數(shù)及菌株鑒定 應用離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取拭子標本DNA，并添加溶葡萄球菌素(Sigma，美國)溶解細菌胞壁。通過菌落的形態(tài)、StaphytectPlus試劑盒及PCR擴增nuc基因[8]鑒定SA，根據(jù)2019年美國臨床實驗室國家標準委員會推薦的頭孢西丁紙片(Oxoid，英國)法及PCR擴增mecA[9]基因及逆行耐甲氧西林金葡菌(MRSA)與甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)的鑒定。ACTT 29213與Col為質控菌株。同一個體一次采樣的不同標本分離出的SA菌株，若分子型相同則計為1株；不同個體、同一個體不同次或同一個體同次不同標本的分離菌株類型或分子型不同，計為不同菌株。

1.5.3 菌株分型 采用PCR方法。①多位點序列分型(MLST)：擴增7個管家基因，包括arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。引物序列參照Enright等[10]設計。PCR產物行雙向測序(北京天一輝遠公司)。將測序結果在MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://saureus.mlst.net)比對等位基因的序列型(ST)。②葡萄球菌A蛋白(spa)分型：引物序列參照Koreen等[11]設計。產物行雙向測序(北京天一輝遠公司完成)，并將測序結果在spa分型數(shù)據(jù)庫(http://spaserver.ridom.de/)進行比對分型。③MRSA盒式染色體(SCCmec)基因分型：PCR引物序列參照Milheirico等[12]設計。

1.5.4 毒力及耐藥基因檢測SA菌株毒力的殺白細胞素(PVL)基因引物序列參照Hesje等[13]設計，ATCC 29253作為質控菌株。SA菌株的耐藥基因葡萄球菌附屬調控因子(sarA)引物序列參照Azmi等[14]設計。PCR產物進行電泳，并用凝膠成像儀觀察結果。PVL陽性與SA致病毒力有關，sarA陽性提示菌株對抗生素耐藥。

1.5.5SA定植菌株的抗生素最低抑菌濃度(MIC)范圍測定 青霉素、紅霉素、頭孢曲松、苯唑西林、美羅培南、利奈唑胺、萬古霉素的MIC值采用E-test法檢測。質控菌株ATCC 29213各抗菌藥物的MIC值質控允許范圍及SA藥物敏感性判別標準依據(jù)美國臨床實驗室國家標準委員會(CLSI)2019年標準[15]，其中美羅培南、頭孢曲松的耐藥折點標準參照2019年CLSI中“其他非腸桿菌科菌”的標準[15]。

1.6 分組 以SA定植數(shù)量分為單部位定植組、2個部位定植組和多部位(≥3個)定植組。

1.7 臨床資料收集 采集患兒性別、入院日齡、分娩方式、入院前母乳喂養(yǎng)、入院前應用抗生素、入院時氣管插管常頻機械通氣、住院天數(shù)等臨床信息。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用病例數(shù)或菌株數(shù)及率表示，率的比較用χ2檢驗或Fisher's確切概率法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 圖1顯示，符合本文納入和排除標準的新生兒766例，其中257例(33.6%)存在≥1個部位的SA定植，單部位定植組135例(52.5%)，2個部位定植組65例(25.3%)，≥3個部位定植組57例(22.2%)。

2.2SA不同定植數(shù)量及其定植部位 單部位定植組：鼻前庭74例、臍根部28例、腋下22例、腹股溝11例；2個部位定植組：鼻前庭+臍根部29例、鼻前庭+腹股溝12例、鼻前庭+腋下11例、臍根部+腹股溝10例、臍根部+腋下2例、腋下+腹股溝1例；≥3個部位定植組：鼻前庭+臍根部+腋下+腹股溝35例、鼻前庭+臍根部+腋下15例、臍根部+腋下+腹股溝5例、鼻前庭+腋下+腹股溝2例。

2.3 不同定植數(shù)量與臨床特征、菌株分型、PVL、sarA基因狀態(tài) 表1顯示，≥1個部位SA定植的257例新生兒中，男140 例(54.5%)，女117例，入院日齡(12.4±9.3)d，剖宮產105例 (40.9%)，入院前純母乳喂養(yǎng)125例(48.6%)，入院前應用抗生素40例(15.6%)，入院時氣管插管常頻機械通氣18例(7.0%)，住院天數(shù)(9.2±4.7)d，PVL陽性62例，sarA陽性139例，MRSA 59例。SA1、2和≥3個部位定植組的臨床特征、菌株分型、PVL、sarA基因狀態(tài)比較中，僅PVL陽性差異有統(tǒng)計學意義。PVL陽性中，≥2個部位定植與單部位定植比較，差異也有統(tǒng)計學意義[39(32.0%)vs23 (17.0%)，P=0.005]。sarA陽性中，≥2個部位定植與1個部位定植比較，差異有統(tǒng)計學意義[83(68.0%)vs56 (41.5%) ,P<0.01]。

圖1 研究對象的納入和排除流程圖

2.4SA不同定植部位與耐藥 表2顯示，鼻前庭、臍根部、腋下和腹股溝分別培養(yǎng)出176、124、72和76株，MSSA占比分別為82.4%、77.4%、80.6%和80.3%。鼻前庭、臍根部、腋下和腹股溝的MRSA和MSSA差異均無統(tǒng)計學意義。

MSSA中占比>10%的ST分型有，ST398 型36株、ST22型 34株、ST15型31株、ST188型 28株；占比>10%的spa分型有，t309型29株、t189型28株。MSSA菌株最常見的克隆型為ST398-t309型。

MRSA中占比>10%的ST分型為ST59 型41株；占比>10%spa的分型為 t437型31株。MRSA的SCCmec分型，Ⅳ型51株和Ⅴ型8株。MRSA菌株最常見的克隆型為ST59-SCCmecIV-t437。

2.5 定植SA的毒力及耐藥性PVL基因檢測陽性62株(21.5%)，MRSA和MSSA陽性率(27.1%vs20.1%，χ2=1.373，P=0.255)差異無統(tǒng)計學意義；sarA基因檢測陽性139株(45.8%)，MRSA和MSSA陽性率(54.2%vs46.7%，χ2=1.060，P=0.303)差異無統(tǒng)計學意義；PVL+sarA基因檢測均陽性25株，MRSA和MSSA中PVL+sarA基因檢測均陽性率(28%vs7.9%，χ2=0.949，P=0.33)差異無統(tǒng)計學意義。

2.6SA定植菌株的抗生素MIC范圍及耐藥率 表3顯示，288株均對莫匹羅星、利奈唑胺及萬古霉素敏感；15株美羅培南不敏感株，其中MRSA 14株(1株耐藥，13株中介)，MSSA 1株(中介)；總體耐藥率從高到低依次為青霉素、紅霉素、頭孢曲松、苯唑西林；青霉素、紅霉素、苯唑西林耐藥率MRSA高于MSSA，頭孢曲松耐藥率MSSA高于MRSA，差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 不同定植數(shù)量分組的臨床特征、菌株分型、PVL、sarA基因狀態(tài)比較[n(%)]

表2 SA不同定植部位的耐藥情況[n (%)]

表3 SA定植菌株的抗生素最低抑菌濃度范圍及耐藥率 (n=288)

3 討論

本文NICU住院新生兒的體表SA定植率33.6%,1、2、≥3個部位定植分別為52.5%、25.2%、22.3%?！?個部位定植較1個定植部位致病毒力(PVL陽性)更強，對抗生素暴露更容易產生耐藥。SA定植部位以鼻前庭、臍根部為主，其次為腋下和腹股溝，MSSA占比77.4%～82.4%，MSSA菌株最常見的克隆型為ST398-t309型，MRSA菌株最常見的克隆型為ST59-SCCmecIV-t437。耐藥率從高到低依次為青霉素、紅霉素、頭孢曲松和苯唑西林,對莫匹羅星、利奈唑胺及萬古霉素敏感；檢出15例對美羅培南不敏感菌株。

本課題組前期研究僅采集了鼻前庭部位的拭子標本，NICU住院新生兒在入院3 d內SA定植率為17.9%[4]，本研究NICU患兒入院24 hSA總定植率為33.6%，其中鼻前庭SA定植率23.1%，前期研究較本研究鼻前庭SA定植率低的原因，可能與前期入院3 d內采集拭子，增加了抗生素暴露的機會，當然也不排除SA本身存在隨時間推移而定植率逐漸升高的變化趨勢。多項研究顯示，單一鼻前庭采樣的SA定植率為6.7%～25.8%[1,16-18]，而多部位同時送檢可增加SA的檢出率，其中鼻前庭與臍部的SA檢出率最高[6,19]，本研究多部位SA定植率為47.5%，且不論是單部位定植、2個部位定植還是≥3個部位定植，均以鼻前庭+臍根部為主。SA定植的多部位聯(lián)合監(jiān)測具有更加重要的臨床意義。

本研究SA1、2和≥3個部位定植組性別、入院日齡、剖宮產、入院前純母乳喂養(yǎng)、入院前應用抗生素、入院時氣管插管常頻機械通氣、住院天數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義，需要說明的是，本研究并未納入需要血管活性藥物維持血壓和需要高頻振蕩輔助通氣的病危兒，或不能真實反映所有需氣管插管呼吸支持新生兒的SA定植狀況。

本研究PVL、sarA、PVL+sarA基因檢測陽性的MRSA和MSSA陽性率差異無統(tǒng)計學意義，鼻前庭、臍根部、腋下和腹股溝的MRSA和MSSA差異均無統(tǒng)計學意義，說明不論是MRSA還是MSSA，在致病性、侵襲性和耐藥性上沒有差別，在定植部位分布上沒有差別。

本研究中MRSA的主要流行克隆為ST59-IV-t437，這也是我國成人、兒童鼻腔MRSA定植及MRSA感染的主要流行克隆[20-22]。但MRSA的流行克隆在不同國家存在差別。Geraci等[23]報道ST22是意大利NICU鼻腔定植MRSA最常見的ST，而韓國兒童MRSA定植與感染最常見的ST為ST72[24]。MSSA的克隆型呈現(xiàn)多樣化，未發(fā)現(xiàn)明顯優(yōu)勢的克隆型，其中ST22相對常見，僅次于ST398。本課題組前期研究鼻腔定植MSSA中未檢出ST22[4]。2013年前，未檢索到我國大陸地區(qū)ST22克隆型的相關報道，近幾年在我國不同地區(qū)相繼出現(xiàn)ST22的流行。楊鑫[25]報道我院2016年2月至2017年9月MSSA臨床分離株中ST22分離率為20.7%，高于其他克隆型。重慶、新疆地區(qū)也報道ST22為該地區(qū)MSSA的主要克隆型[22,26]。上述結果提示近些年我國部分地區(qū)MSSA菌株的流行克隆的分布發(fā)生了一些改變，流行病學監(jiān)測應關注ST22的耐藥等特征及其流行病學變遷。

本研究結果顯示SA定植菌株對青霉素與紅霉素的耐藥率均較高，文獻報道兒童呼吸道SA感染的MRSA對美羅培南的敏感率100%[4,27]，

而本研究發(fā)現(xiàn)新生兒鼻前庭、臍帶及腋下等皮膚部位有23.7%的MRSA對美羅培南不敏感，提示新生兒體表定植的SA可能與兒童致病SA的耐藥性存在差異，當然也不排除各學科(包括產科在孕期的)的抗生素不合理使用加重了細菌耐藥發(fā)生的因素。

本研究的局限性：①拭子采樣于夏末至次年的冬季，不能反映NICU住院患兒的春季和夏季SA定植差異；②主要反映的是NICU相對病情穩(wěn)定的新生兒鼻腔和體表皮膚SA定植情況，外延到所有NICU患兒SA定植需要謹慎；③結論來自于北京一家兒童?？漆t(yī)院，外延到所有NICU患兒SA定植也需要謹慎對待。