半夏厚樸湯對卒中后抑郁大鼠的干預機制研究

高 宗，楊家應(yīng)，張念平，苗秀明

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.蘭陵縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 臨沂 277700；3.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

卒中后抑郁癥(Post-stroke depression，PSD)屬于繼發(fā)性抑郁，是繼發(fā)于腦卒中后的一種包括精神、軀體及心理癥狀的復雜情感障礙性疾病，PSD發(fā)病率為30%～50%[1-2]。PSD的臨床表現(xiàn)為興趣減退、睡眠障礙、自殘、自殺等，降低了患者生活質(zhì)量，甚至可導致患者產(chǎn)生自殺行為[3]。臨床往往采用抗抑郁藥物及相應(yīng)的心理疏導治療PSD，但效果不佳，且抗抑郁藥物多有毒蕈堿樣不良反應(yīng)[4]。中醫(yī)學認為PSD屬“中風”“郁癥”范疇，中風患者氣血不和，氣血逆竄，擾犯脈絡(luò)，蒙蔽腦竅，以致情志不暢，氣機郁滯，即“因病而郁”，中風并發(fā)郁證后氣機不暢，形成痰、瘀等病理產(chǎn)物，從而形成“因病致郁，因郁致病”互為因果的惡性循環(huán)。PSD實證多為氣郁、痰濕、瘀血所致，虛證多由病情遷延日久，火郁傷陰或氣血生化不足所致。半夏厚樸湯載于漢代張仲景的《金匱要略》，是治療抑郁癥的良方。課題組前期研究證明半夏厚樸湯具有抗抑郁作用[5]。半夏有化痰通絡(luò)的功效，既往相關(guān)文獻報道半夏可用于卒中的治療，因此我們推測半夏厚樸湯可通過抗抑郁、抗卒中發(fā)揮對PSD較好的治療作用。本研究建立大鼠PSD模型，探討半夏厚樸湯治療PSD療效及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級健康成年雄性SD大鼠40只，體重(200±20)g，購自北京阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK(京)2018-0006。在山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗室進行實驗，許可證號SYXK(魯)20180015。

1.1.2 實驗試劑與儀器：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18) ELISA檢測試劑盒(批號lot H052-1、lot H002、lot H015，南京建成科技有限公司)。半夏厚樸湯方藥組成：半夏、茯苓、郁金各12 g，厚樸9 g，生姜、柴胡、合歡皮各15 g，蘇葉6 g，以上藥物煎煮前涼水浸泡20 min，武火煎開后文火再煎30 min，相當于3.5 g/ml生藥量。LEICA-石蠟切片機(型號RM2135，德國萊卡公司)；低速離心機(型號LD4-2A，北京醫(yī)用離心機廠)；顯微鏡(型號BH，日本奧林帕斯公司)；酶標分析儀(型號DNM-9602G，中國普朗公司) 。

1.2 實驗方法

1.2.1 PSD模型的建立：大鼠局灶性腦缺血模型的建立[6]：術(shù)前 12 h禁食不禁水，10%水合氯醛3 ml/kg經(jīng)腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，沿頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露左側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)、頸外動脈、頸內(nèi)動脈、頸內(nèi)動脈的顱外分支翼腭動脈，在近心端結(jié)扎頸總動脈，在頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，結(jié)扎翼腭動脈。將頸內(nèi)動脈遠心端用動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的碳素魚線，去除動脈夾，沿著頸內(nèi)動脈輕輕向前推進，注意不要誤入翼腭動脈，推進約18 mm左右時結(jié)扎頸內(nèi)動脈并固定魚線。青霉素局部消毒后縫合皮膚，術(shù)后保持室溫在25～30 ℃。假手術(shù)組動物除手術(shù)過程中不插入線栓外，其他過程均相同。模型成功的標志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征。卒中后抑郁大鼠模型的制備參考Willner和Katz方法[7]：禁食禁水20 h；禁水17 h；傾斜鼠籠45° 17 h；持續(xù)光照17 h；濕籠(100 g鋸屑加200 ml水)21 h；4 ℃游泳5 min；水平搖晃5 min；行為限制2 h；夾尾1 min。9種刺激每天隨機采取1種連續(xù)干預21 d。

1.2.2 分組和給藥：將40只大鼠隨機分為PSD組、半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組、陽性組，每組10只。低劑量組給予1.5 g/kg半夏厚樸湯，高劑量組給予3.0 g/kg半夏厚樸湯，陽性組給予1.7 mg/kg氟西汀，PSD組給予等量0.9%氯化鈉溶液。灌胃給藥，灌胃劑量為2 ml/kg。灌胃 21 d后造模，造模后繼續(xù)給藥21 d。

1.2.3 行為學檢測：模型建立后第0、1、2、3周行曠野實驗測試，每周行蔗糖偏好實驗并測量體重。曠野實驗：室內(nèi)隔音，測定5 min水平運動得分。蔗糖偏好實驗：20 h 禁食禁水后，測定1 h糖水飲用比例，糖水飲用比例=(糖水消耗÷總液體消耗)×100%。

1.2.4 腦組織病理學觀察：大鼠麻醉后，暴露頸右總動脈，插管，輸注0.9%氯化鈉溶液50 ml，然后輸注4%多聚甲醛50 ml，斷頭取腦。予甲醛溶液固定腦組織，選擇梗死組織，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成 4～6 μm 厚的切片，行蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察梗死中心區(qū)、梗死周邊區(qū)腦組織。

1.2.5 海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-18水平檢測：冰浴下迅速分離海馬組織，制備組織勻漿，3000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、TNF-α、IL-18表達水平。

1.2.6 腦梗死面積檢測：大鼠取腦后，從額極向枕葉依次切割2 mm厚度切片，共7張。四氮唑紅避光染色15 min，染色結(jié)束后4%多聚甲醛固定，顯微鏡下拍照計算腦梗死面積，梗死灶為蒼白色，正常組織為紅色。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織病理學觀察 見圖1。PSD組可見神經(jīng)元胞核腫大、偏位、核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化。半夏厚樸湯高劑量組和半夏厚樸湯低劑量組均可見不同程度神經(jīng)細胞的核深染、核固縮，細胞及間質(zhì)的水腫減輕，神經(jīng)細胞核仁清晰可見。陽性組神經(jīng)元細胞核縮小，邊界及核仁清楚，細胞間質(zhì)水腫較輕。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學表現(xiàn)(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠體重比較 見表1。治療1周后，半夏厚樸湯高劑量組體重均高于PSD組、陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療2、3周后，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組和陽性組體重均高于PSD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重比較(g)

2.3 各組大鼠水平運動得分比較 見表2。治療1、2、3周后，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組和陽性組水平運動得分均高于PSD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療2、3周后，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組水平運動得分均低于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠水平運動得分(分)

2.4 各組大鼠蔗糖偏好實驗情況比較 見表3。治療2、3周后，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組和陽性組糖水消耗量均高于PSD 組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療2、3周后，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組糖水消耗量均低于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠糖水消耗量比較(ml)

2.5 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-18水平比較 見表4。從本次研究結(jié)果來看，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組、陽性組的TNF-α、IL-1β、IL-18水平均低于PSD 組的大鼠海馬組織中水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。半夏厚樸湯高劑量組TNF-α、IL-1β水平低于陽性組大鼠海馬組織中水平，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較(pg/ml)

2.6 各組大鼠腦梗死面積比較 在進行治療后對各組大鼠腦梗死面積進行測量、記錄。治療后，PSD組腦梗死面積為(133.0±3.4)mm2，半夏厚樸湯低劑量組腦梗死面積為(113.3±4.7)mm2，半夏厚樸湯高劑量組腦梗死面積為(99.2±5.2)mm2，陽性組腦梗死面積為(114.8±3.9)mm2。從上述結(jié)果來看，半夏厚樸湯低劑量組、半夏厚樸湯高劑量組、陽性組腦梗死面積均低于PSD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，在組間比較中，半夏厚樸湯高劑量組腦梗死面積低于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

中醫(yī)學認為，中風后臟腑虧虛，腎虛精虧，氣機不利，致血行不暢，瘀血內(nèi)停，痹阻腦絡(luò)，清竅被蒙，髓海失養(yǎng)，腦失所充而致中風后抑郁癥，治療當以疏肝理脾、化痰理氣為治療大法[8-10]。半夏厚樸湯為理氣劑，是治療痰氣郁結(jié)之郁證的經(jīng)典方劑，可奏行氣化痰、降逆散結(jié)之效。半夏為君藥，性溫、味辛、有毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功效。厚樸、茯苓為臣藥，厚樸味苦、辛，性溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕消痰、下氣除滿的作用；茯苓味甘淡，性平，歸心、脾經(jīng)，具有利水滲濕、健脾安神的功效，厚樸降氣助半夏散結(jié)，茯苓滲濕利水助半夏以化痰。生姜辛散之力強，善走中上二焦，有解表散寒、調(diào)和營衛(wèi)、溫中止嘔、溫肺止咳功效，生姜與半夏合用可制半夏之毒。蘇葉芳香理氣，疏肝理肺[9-13]。全方辛、苦合用，行氣散結(jié)，燥濕降逆，使郁氣得疏，痰涎得化，情志舒暢。

本研究結(jié)果顯示不同劑量的半夏厚樸湯可顯著增加PSD大鼠的曠野實驗水平運動得分、糖水消耗量和體重，提示半夏厚樸湯可緩解PSD大鼠的抑郁狀態(tài)。目前，PSD的發(fā)病機制尚不明確。海馬是調(diào)控下丘腦-垂體-腎上腺軸活性的重要組成部分[14]。頭顱MRI顯示，抑郁癥患者海馬體積變小，并且其縮小程度與抑郁嚴重程度呈正相關(guān)[15]。影像學研究及動物應(yīng)激模型證實中度抑郁患者海馬體積減少，使用抗抑郁藥可逆轉(zhuǎn)海馬萎縮，從而提出了海馬神經(jīng)再生障礙假說[16]。本研究結(jié)果顯示不同劑量組半夏厚樸湯腦梗死面積低于PSD組，且半夏厚樸湯高劑量組優(yōu)于陽性組。病理學研究結(jié)果也顯示不同劑量組半夏厚樸湯治療可降低神經(jīng)元細胞的損傷。

現(xiàn)代藥理學研究顯示，半夏厚樸湯可抑制機體炎癥反應(yīng)，抑制炎癥小體信號通路，改善抑郁癥患者的情緒狀態(tài)；同時，可降低抑郁大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素和血清皮質(zhì)酮分泌，調(diào)節(jié)HPA軸，抑制HPA軸功能亢進[17-18]。半夏厚樸湯可促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，緩解神經(jīng)元萎縮，減輕氧化應(yīng)激，增加大鼠海馬內(nèi)SOD的活性，降低MDA含量[19-20]。另外，半夏厚樸湯可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，增加抑郁動物腦內(nèi)5-HT和DA含量，從而改善抑郁狀態(tài)[21]。同時，細胞因子網(wǎng)絡(luò)可能參與了PSD的發(fā)病。PSD患者予抗炎性細胞因子或抗抑郁治療后，機體炎性細胞因子水平降低或抗炎性細胞因子水平升高，細胞因子網(wǎng)絡(luò)重新達到穩(wěn)態(tài)，進而減少對海馬組織的損傷，改善患者抑郁癥狀[22]。多項實驗表明，卒中后炎性細胞因子IL-1β、TNF-α表達升高，促進機體炎癥反應(yīng)，TNF-α及 IL-1β可損傷缺血再灌注后的海馬神經(jīng)元，抑制IL-1β及TNF-α的合成，可減輕谷氨酸引起的細胞損傷[23-24]。IL-18是重要的促炎性細胞因子，參與炎癥、自身免疫性疾病、特定精神疾病等多種生理病理過程[25]。大量研究證實，外傷性或缺氧缺血性腦損傷合并抑郁患者及外界應(yīng)激所致抑郁患者血清IL-18均升高，抗抑郁藥可通過降低促炎性細胞因子IL-18的表達改善抑郁樣行為[26]。本研究結(jié)果顯示不同劑量半夏厚樸湯可降低PSD大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-18水平，促進PSD大鼠細胞因子網(wǎng)絡(luò)達到穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，半夏厚樸湯可改善PSD大鼠抑郁癥狀，減少梗死面積，其作用機制可能與半夏厚樸湯促進細胞因子網(wǎng)絡(luò)達到穩(wěn)態(tài)有關(guān)。