苦蕎提取物的化感作用及化學(xué)成分分析

馬光宗，楊云海，徐高峰，楊韶松，張付斗，申時(shí)才，葉 敏

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205）

0 引言

植物化感物質(zhì)是主體植物釋放的次生代謝產(chǎn)物，通過(guò)自身根系分泌，莖葉雨霧淋溶、揮發(fā)或者殘?bào)w分解等多種途徑釋放到自然界中，從而抑制或者促進(jìn)其他植物生長(zhǎng)[1]。目前，田間雜草是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一，防控措施以化學(xué)除草劑為主，大量除草劑的使用不僅產(chǎn)生了抗藥性，更為嚴(yán)重的是其本身高毒、高殘留，難以在生態(tài)環(huán)境中降解[2]?；凶饔米鳛橐环N環(huán)境友好型的生態(tài)控草方法受到越來(lái)越多的關(guān)注。利用作物自身遺傳的防御或抗逆能力，很少產(chǎn)生殘留等環(huán)境危害，對(duì)農(nóng)田雜草生態(tài)治理體系具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值[3-4]。因此，研究植物化感作用對(duì)植物源除草劑的開(kāi)發(fā)利用以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)田雜草生態(tài)管理具有重要意義。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)起源于中國(guó)和亞洲北部地區(qū)，為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生雙子葉作物[5]，具有生育期短、耐冷涼、耐貧瘠、適應(yīng)性較強(qiáng)等特點(diǎn)，常作為山區(qū)、丘陵區(qū)輪作換茬的重要作物之一[6]。作為一種重要的小宗雜糧作物和藥食同源植物，苦蕎在中國(guó)主要分布于西南、華北、西北等省區(qū)[7]?？嗍w含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健成分，尤其是在預(yù)防糖尿病、高血糖、高血脂等方面有重要作用[8-9]。隨著人們對(duì)苦蕎保健價(jià)值的肯定，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值、種質(zhì)資源與農(nóng)藝性狀、栽培技術(shù)、遺傳多樣性等受到廣泛的研究[10-11]。有研究表明，金蕎麥地上部和地下部不同溶劑提取物對(duì)細(xì)菌和真菌有一定的抑制作用，抑菌活性成分為一些極性較強(qiáng)的物質(zhì)[12]，苜蓿和蕎麥混播時(shí)苜蓿產(chǎn)草與蕎麥播種量和產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)[13]，適量的秸稈還田具有良好的雜草抑制效應(yīng)及苦蕎增產(chǎn)效應(yīng)[10]，苦蕎不同部位提取物對(duì)油菜和苜蓿具有明顯的化感作用[14]。然而，目前關(guān)于苦蕎對(duì)農(nóng)田雜草的控制作用、化感作用及其化感物質(zhì)方面研究甚少。

筆者采用水提液溶劑梯度萃取法提取苦蕎化感物質(zhì)，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析鑒定萃取物中的化學(xué)成分，并以馬唐(Digitaria sanguinalis)和三葉鬼針草(Bidens pilosa)2種雜草為受體植物測(cè)定了萃取物的化感潛力，以期將苦蕎應(yīng)用于農(nóng)田雜草控制，為其活性物質(zhì)用于新型除草劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦蕎于2020年采自云南省曲靖市師宗縣葵山鎮(zhèn)，為村民長(zhǎng)期種植的本地品種。

馬唐和三葉鬼針草為云南省部分主要的農(nóng)田惡性雜草種類(lèi)，2019年在云南省各主要分布區(qū)采集的種子，經(jīng)鑒定后保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎萃取物的提取和制備 稱(chēng)取500 g陰干粉碎后的苦蕎，其中包括地上部分350 g、地下部分150 g。按1:5(w/w)的固液比加入蒸餾水，浸泡24 h，浸泡期間采用超聲波水?。ǔ暡l率35 kHz，功率500 W，溫度25℃）輔助提取，過(guò)濾得濾液，再將過(guò)濾后的殘?jiān)貜?fù)上述操作，合并2次提取所得濾液，得到固液比為1:10(w/w)的苦蕎水浸提液。采用溶劑梯度萃取法，按溶劑極性從小到大的順序用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇將所得的水提液順序萃取4次，合并相應(yīng)的萃取液，將各有機(jī)溶劑萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到相對(duì)應(yīng)的提取物浸膏。將所得到的浸膏分別裝入棕色廣口瓶中，密封保存與4℃冰箱備用。

1.2.2 苦蕎萃取物成分分析 將苦蕎石油醚相和乙酸乙酯相萃取物用乙酸乙酯配制成1000 mg/L的溶液，采用GC-MS進(jìn)行化學(xué)成分分析（氣相色譜儀Agilent7890，四級(jí)桿質(zhì)譜儀Agilent5975N）。GC分析條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（內(nèi)徑30 m×0.25 mm，膜厚0.25μm）；進(jìn)樣口溫度230℃；柱溫初始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min的速率升溫至250℃，保持6 min，柱流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0μL；分流比5:1。MS分析條件：電離方式EI，電離能70 eV，四級(jí)桿溫度150℃，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍 50～550m/z，載氣(He)流速1.0 mL/min，溶劑延遲6 min。2種萃取物GC-MS分析數(shù)據(jù)采用NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索。

1.2.3 生物活性測(cè)定 選取大小一致且無(wú)殘缺、籽粒飽滿(mǎn)、發(fā)芽率在90.0%以上的馬唐和三葉鬼針草種子，用10.0%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，蒸餾水漂洗3次，晾干備用。稱(chēng)取一定量萃取物浸膏，先使用少量丙酮溶解（最終濃度為3.0%，前期試驗(yàn)表明不影響植物正常生長(zhǎng)），然后用蒸餾水稀釋至濃度2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL藥液，分別吸取1 mL藥液均勻倒入放有雙層濾紙鋪的直徑為3 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中均勻放置10粒已消毒的馬唐或三葉鬼針草種子，以加入3.0%丙酮的水溶液為對(duì)照，各設(shè)置3次重復(fù)。置于人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)，溫度25℃、相對(duì)濕度70.0%、出芽后每天光照12 h。試驗(yàn)總萌發(fā)時(shí)間為7天，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，測(cè)量各植株株高、根長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

化感作用響應(yīng)指數(shù)(response index，RI)采用Willamson等[15]的公式計(jì)算，如式(1)。

式中，T為處理值，C為對(duì)照值。RI>0表示促進(jìn)作用，RI<0表示抑制作用，RI=0表示既無(wú)促進(jìn)作用也無(wú)抑制作用，絕對(duì)值的大小與作用強(qiáng)度一致。

采用DPSV 9.50版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，分析不同處理間的差異。采用Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎萃取物成分分析

苦蕎通過(guò)水提液溶劑梯度萃取得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3種萃取物，得率分別為0.02%、0.06%和0.24%(w/w)。生物測(cè)定結(jié)果表明，正丁醇相中活性物質(zhì)成分含量較低，且多數(shù)為大分子物質(zhì)，因此選擇石油醚相和乙酸乙酯相進(jìn)行化學(xué)成分分析。利用GC-MS分析法從石油醚相中鑒定出24種含量大于0.5%的化學(xué)成分，占總出峰面積的98.7%（圖1和表1），主要成分為4-乙基苯酚(26.8%)、5-羥基-6-甲氧基-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮(9.5%)、棕櫚酸(9.0%)、4-甲基吲哚(9.0%)、吲哚(8.2%)，其余含量均低于5.0%。從乙酸乙酯相中鑒定出19種含量大于0.5%的化學(xué)成分，占總出峰面積的97.6%（圖2和表2），主要成分為四氫熏衣草醇(20.7%)、異次羊脂酸(12.0%)、正二十八烷(11.3%)、4-乙基苯酚(8.7%)、2-甲基丁酸(7.9%)、偏三甲苯(5.8%)、棕櫚酸(5.1%)，其余含量均低于5.0%。其中，石油醚相和乙酸乙酯相中均鑒定出4-乙基苯酚和棕櫚酸2種成分。

圖1 苦蕎石油醚相總離子流圖

圖2 苦蕎乙酸乙酯相總離子流圖

表1 苦蕎石油醚相的化學(xué)成分

續(xù)表1

表2 苦蕎乙酸乙酯相的化學(xué)成分

續(xù)表2

2.2 苦蕎萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草種子萌發(fā)的影響

苦蕎萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草種子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，萃取物濃度顯著影響馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)（表3）。隨著供體萃取物濃度的逐漸升高，對(duì)受體種子萌發(fā)的抑制作用顯著增強(qiáng)。石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3種萃取物濃度為1.00和2.00 mg/mL時(shí)，馬唐和三葉鬼針草的萌發(fā)率顯著高于對(duì)照。濃度為2.00 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率均為0.0%，石油醚相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率與對(duì)照相比下降了80.0和56.7個(gè)百分點(diǎn)，正丁醇相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率與對(duì)照相比下降了60.0和26.7個(gè)百分點(diǎn)，均與對(duì)照差異顯著。3種萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草的影響效果因濃度不同而有所差異，低濃度(0.25～0.50 mg/mL)處理下馬唐種子萌發(fā)率均大于或等于三葉鬼針草，而高濃度(1.00～2.00 mg/mL)處理下馬唐種子萌發(fā)率均小于三葉鬼針草。結(jié)合化感響應(yīng)指數(shù)RI值分析，3種萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草發(fā)芽率的抑制由強(qiáng)至弱表現(xiàn)為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。

表3 苦蕎萃取物對(duì)2種雜草種子發(fā)芽率的影響

2.3 苦蕎萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3.1 苦蕎萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草莖長(zhǎng)的影響 研究結(jié)果（表4和圖3～4）顯示，經(jīng)萃取物處理的種子生長(zhǎng)分化后，馬唐和三葉鬼針草幼莖長(zhǎng)度與萃取物濃度總體上呈負(fù)相關(guān)，抑制作用為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。乙酸乙酯相各濃度處理莖長(zhǎng)抑制率均大于石油醚相和正丁醇相（除0.25 mg/mL濃度外），2.00 mg/mL處理濃度下，乙酸乙酯相能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼莖的生長(zhǎng)，石油醚相的抑制率分別為81.0%和60.0%，而正丁醇相的抑制率僅為49.0%和22.0%。正丁醇相在低濃度(0.25 mg/mL)處理濃度下對(duì)馬唐的莖長(zhǎng)化感響應(yīng)指數(shù)分別為0.10，在0.25～0.50 mg/mL處理濃度下對(duì)三葉鬼針草的莖長(zhǎng)化感響應(yīng)指數(shù)為分別為0.03和0.05，其余處理均為負(fù)值，具有“低促高抑”的現(xiàn)象。相同處理下馬唐的莖長(zhǎng)化感響應(yīng)指數(shù)均小于三葉鬼針草，說(shuō)明2種雜草對(duì)莖長(zhǎng)敏感度馬唐要強(qiáng)于三葉鬼針草。

表4 苦蕎萃取物對(duì)2種雜草幼苗生長(zhǎng)化感效應(yīng)指數(shù)的影響

圖3 苦蕎萃取物對(duì)馬唐幼莖和幼根生長(zhǎng)的影響

圖4 苦蕎萃取物對(duì)三葉鬼針草幼莖和幼根生長(zhǎng)的影響

2.3.2 苦蕎萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草根長(zhǎng)的影響研究結(jié)果表明，苦蕎萃取物處理馬唐和三葉鬼針草種子對(duì)其幼根長(zhǎng)度的影響不同，抑制效果隨著濃度的增大而增強(qiáng)。其中乙酸乙酯相抑制效果最明顯，濃度大于0.50 mg/mL對(duì)2種雜草的抑制率達(dá)61.0%以上，2.00 mg/mL濃度處理能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼根的生長(zhǎng)。同樣的，石油醚相也具有較好的抑制效果，2.00 mg/mL濃度處理能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼根的生長(zhǎng)。正丁醇相效果最差，2.00 mg/mL濃度處理對(duì)馬唐和三葉鬼針草幼根僅有53.0%和29.0%的抑制率，且在0.25 mg/mL濃度處理下根長(zhǎng)化感響應(yīng)指數(shù)分別為0.08和0.06，說(shuō)明低濃度具有促進(jìn)幼根生長(zhǎng)的作用。從3種萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)的化感響應(yīng)指數(shù)對(duì)比看，對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用要大于莖長(zhǎng)。

3 討論

3.1 受體植物及評(píng)測(cè)指標(biāo)選擇優(yōu)勢(shì)

化感物質(zhì)作為植物間的一種重要化學(xué)信號(hào)物質(zhì)，作用于植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段而對(duì)植物產(chǎn)生影響，如影響種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)等，最終導(dǎo)致植物種群被抑制[16-17]。因此，利用化感作用可以選擇性地對(duì)一些惡性雜草進(jìn)行防控[18]。馬唐和三葉鬼針草通常為農(nóng)田上的主要雜草，三葉鬼針草為入侵性雜草，而馬唐則為本地惡性雜草[19-20]。2種雜草通常具有種子數(shù)量大、種子萌發(fā)率高、生長(zhǎng)速度快等特征，因此在雜草群落中容易形成單一群落或成為優(yōu)勢(shì)種群，從而對(duì)農(nóng)作物蔬菜、玉米、甘蔗等造成嚴(yán)重的危害[19-20]。本研究表明，苦蕎3種萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草種子萌發(fā)、幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均有一定的抑制作用，且隨濃度增加而顯著增強(qiáng)。種子萌發(fā)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，化感物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)的抑制，會(huì)降低種子發(fā)芽速度，延長(zhǎng)出苗時(shí)間，嚴(yán)重影響植物對(duì)地上和地下資源的競(jìng)爭(zhēng)能力[21-22]。因此，苦蕎的種植可以抑制土壤種子庫(kù)中馬唐和三葉鬼針草種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，從而降低其種群密度和危害。

3.2 化感作用響應(yīng)指數(shù)評(píng)價(jià)

化感作用響應(yīng)指數(shù)用于度量化感作用的類(lèi)型和強(qiáng)度[15]，其中對(duì)受體植物種子萌發(fā)、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的影響通常是衡量化感作用強(qiáng)度最重要的指標(biāo)。本研究表明，苦蕎不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)馬唐和三葉鬼針草的種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的化感響應(yīng)指數(shù)變化趨勢(shì)基本一致。3種不同萃取物中，乙酸乙酯相的化感作用響應(yīng)指數(shù)最低，即對(duì)馬唐和三葉鬼針草的化感抑制作用最強(qiáng)，其次是石油醚相，最差的是正丁醇相，這與王力超[23]報(bào)道乙酸乙酯萃取物對(duì)入侵植物喜旱蓮子草幼苗生長(zhǎng)的化感抑制作用最強(qiáng)，其次是石油醚萃取物和正丁醇萃取物相一致。3種不同萃取物對(duì)馬唐的抑制作用大于三葉鬼針草，對(duì)根長(zhǎng)的抑制明顯大于莖長(zhǎng)，這與申時(shí)才[22]報(bào)道的紅薯葉片水浸液對(duì)馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)一致。

3.3 苦蕎活性物質(zhì)成分分析

苦蕎中含有豐富的生理活性物質(zhì)，而這些物質(zhì)往往以次生代謝產(chǎn)物為主，主要包括黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)、糖類(lèi)和脂肪酸類(lèi)[24-29]等。已有研究表明，有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)為化感活性主要物質(zhì)[29]。本研究中，利用GC-MS分析法分別從石油醚相和乙酸乙酯相中鑒定出24種和19種化學(xué)成分，含量均高于0.5%，分別占總出峰面積的98.7%和97.6%。其中石油醚相的主要成分為4-乙基苯酚(26.8%)，乙酸乙酯相的主要成分為四氫熏衣草醇(20.7%)。Jane?等[30]報(bào)道苦蕎中的香氣物質(zhì)主要是2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)呋喃酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯乙醛、2-甲氧基-4-乙烯苯酚等。Kim等[31]報(bào)道了苦蕎種子中含有綠緣酸、葒草素、異東方蓼黃素、蘆丁和槲皮苷等。汪嘉慶等[32]從苦蕎中鑒定出烏蘇酸、山柰酚、槲皮素、大黃素、糖苷、蘆丁等。這些結(jié)果與本研究的主要成分差異較大，可能由研究目的、苦蕎品種以及提取工藝差異較大所導(dǎo)致。本研究中鑒定出的絕大多數(shù)化學(xué)成分尚未有相關(guān)生物活性的報(bào)道，因此需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，苦蕎水提液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇相萃取物對(duì)2種雜草馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出不同程度的化感抑制作用，活性依次為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相，且抑制效果與濃度呈正相關(guān)。萃取物對(duì)馬唐的抑制作用總體上大于三葉鬼針草，對(duì)根長(zhǎng)抑制率大于莖長(zhǎng)。利用GC-MS對(duì)乙酸乙酯相和石油醚相的化學(xué)成分分析表明，乙酸乙酯相和石油醚相中含量大于0.5%的化學(xué)成分有41種，其中乙酸乙酯相的主要成分為四氫薰衣草醇、異次羊脂酸、正二十八烷，含量占比分別為20.7%、12.0%、11.3%。石油醚相的主要成分為4-乙基苯酚、5-羥基-6-甲氧基-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮、棕櫚酸、4-甲基吲哚，含量占比分別為26.8%、9.5%、9.0%、9.0%。關(guān)于各種化學(xué)成分的化感活性和化感作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，以找到植物源除草劑先導(dǎo)化合物，為苦蕎大面積的田間替代種植提供理論依據(jù)。