梨花和油菜花揮發(fā)性氣味物質(zhì)的鑒定及差異分析

郭 媛，郭寶貝，張旭鳳，王冰霞，武文卿，宋懷磊，鄭永惠

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，太原 030031；3運城市鹽湖區(qū)果業(yè)發(fā)展中心，山西 運城 044000；4山西省晉中種蜂場，山西 晉中 030600）

0 引言

蟲媒植物與傳粉昆蟲在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了互惠互利的關(guān)系[1]，蟲媒植物通過顏色、氣味等植物性狀引誘傳粉昆蟲幫助其完成傳粉受精的繁育進(jìn)程[2]，昆蟲獲得花蜜、花粉等物質(zhì)回報，因此這些因素直接影響訪花昆蟲的拜訪行為及傳粉效率[3-4]。其中花朵氣味是吸引傳粉昆蟲到訪，獲得傳粉、受精的重要化學(xué)信號[5]。每種蟲媒植物都有其獨特的氣味，本質(zhì)上是通過散發(fā)的揮發(fā)性物質(zhì)吸引傳粉昆蟲[6-7]或者趨避害蟲[8-9]。許多學(xué)者研究了植物揮發(fā)性物質(zhì)對于昆蟲的引誘或者趨避作用，表明其在吸引昆蟲傳粉[10]、草食性昆蟲取食[11]、寄主嗅覺定位[12-13]、植物防御行為[14-15]等方面均發(fā)揮著重要作用。

梨是中國第三大水果，僅次于蘋果、柑橘。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)數(shù)據(jù)庫最新數(shù)據(jù)顯示，截至2017年，國內(nèi)梨栽培面積約96萬hm2，總產(chǎn)量約1653萬t，面積和產(chǎn)量均據(jù)世界首位[16]。梨屬于典型的蟲媒植物，其配子體自交不親和，自花授粉結(jié)實率低[17]，而且由于其花粉粒大[18]、粘性重，自然界的風(fēng)力不能很好的傳播，需要依靠昆蟲來傳粉。已有研究表明，梨樹通過昆蟲傳粉可以顯著提高坐果率[19]、增加產(chǎn)量，同時提升果實的商品性狀[20]。但自然界中，昆蟲并不喜歡采集梨花，尤其是存在其他競爭植物同期開花時，訪問梨花的昆蟲數(shù)量急劇下降[21]。梨花花粉量大且有花蜜分泌，在一定程度上這些物質(zhì)回報可以達(dá)到吸引傳粉昆蟲并順利實現(xiàn)授粉的目的[22]。油菜作為一種重要的蜜源植物，2017年全國總播種面積和總產(chǎn)量分別為665.30萬hm2和1327.41萬t[23]?，F(xiàn)今存在的種植模式中，油菜與梨樹常出現(xiàn)花期重疊，因此，油菜是梨樹花期傳粉昆蟲采集的主要競爭植物[21]。因此對同期開花的梨花和油菜花揮發(fā)性氣味物質(zhì)成分的鑒定并進(jìn)行比較分析，以期了解梨花和油菜花吸引傳粉昆蟲的采集行為機(jī)理，解決梨樹花期授粉難題。

1 材料與方法

1.1 取樣時間

2017、2018年3月25日—4月15日。

1.2 取樣地點

梨花樣本是采自山西省運城市鹽湖區(qū)鴻芝驛鎮(zhèn)孫余村的酥梨(Pyrus bretschneideri)，油菜花樣本是采自山西省運城市鹽湖區(qū)三路里鄉(xiāng)三路里村的甘藍(lán)型油菜(Brassia campestris)。

1.3 取樣方法

1.3.1 花朵取樣 梨花朵于2017年3月25—27日取樣。油菜花朵于2018年3月28—30日取樣。試驗時間內(nèi)每日9:00—18:00，選擇當(dāng)天剛開、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵整花取下，放入取樣瓶中并冷凍保存。每1 g為一個樣本，3次重復(fù)。

1.3.2 花藥取樣 取樣時間同花朵取樣時間。選擇當(dāng)天開放、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵，用鑷子夾取未散粉花藥整個取下，放入EP管中冷凍保存，每1 g為一個樣本，3次重復(fù)。

1.3.3 花蜜取樣 梨花蜜于2017年3月25日—4月1日取樣。油菜花蜜于2018年4月8—15日取樣。試驗時間內(nèi)每日9:00—18:00，用1 mm口徑毛細(xì)管從花朵基部蜜腺處吸取花蜜，吸滿1管，導(dǎo)入到1.5 mL EP管中冷凍保存，集滿1 g為一個樣本，3次重復(fù)。

樣本取樣完成后寄往上海生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行花朵、花藥和花蜜中揮發(fā)性氣味物質(zhì)的檢測。

1.4 固相萃取裝置

色譜儀(HP 7890Agas)，質(zhì)量選擇性檢測器(5975C)，手動萃取固定器，萃取纖維(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，固相萃取試劑瓶(50 mL)，隔膜（18 mm×1.27 mm，聚四氟乙烯/硅膠），密封圈（鋁，中心開口式）。

1.5 試驗方法

萃取纖維在GC注射器中以不分流進(jìn)樣模式270℃加熱1 h后，樣品轉(zhuǎn)移到固相微萃取試劑瓶的頂部，立即使用密封圈和隔膜封口。將裝有樣品的萃取瓶浸入80℃水浴中，用隔膜穿孔針刺破瓶隔，下壓活塞，使纖維置于頂端樣品之上，并在50℃下吸附30 min。完成后抽回纖維頭，并將萃取頭插入GC-MS儀的氣相色譜進(jìn)樣口，推出纖維頭，250℃解吸5 min，完成進(jìn)樣。

1.5.1 GC條件 DB-WAX彈性毛細(xì)管柱(60m×0.25mm×0.25 μm)，載氣He流量1.0 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度250℃。柱溫起始溫度50℃保持1 min，以6.5℃/min升至100℃，保持1 min；以10℃/min升至130℃，保持1 min；再以7℃/min升至150℃，保持1 min；最后以10℃/min升至250℃，保持5 min。

1.5.2 MS條件 接口溫度230℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃。40～550 amu之間全范圍掃描。

1.6 梨和油菜傳粉昆蟲調(diào)查方法

2017年3月25—27日選擇山西運城市鹽湖區(qū)泓芝驛鎮(zhèn)同期種植梨樹和油菜的地塊，梨樹選定3棵樹，油菜劃分5 m×10 m的觀察樣方，每天6:00—18:00網(wǎng)捕進(jìn)入觀測樣地內(nèi)的昆蟲，共調(diào)查3天，將田間采集的昆蟲裝入50 mL離心管中，實驗室內(nèi)對昆蟲進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計和分類鑒定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

通過檢索NIST.11標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫質(zhì)量譜圖確定化合物，運用峰面積歸一化法求得各成分相對含量。用SPSS 22.0進(jìn)行對梨花揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析并得到相關(guān)主成分載荷矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨和油菜全花、花藥和花蜜中揮發(fā)性氣味物質(zhì)成分比較

由表1可知，梨花中共含有氣味物質(zhì)9種，其中花藥含7種、花蜜含4種；2種植物中含共有氣味物質(zhì)5種，分別是乙醇、十甲基環(huán)戊硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷、十四甲基環(huán)庚硅氧烷和六甲基環(huán)三硅氧烷。油菜全花、花藥、花蜜中所含揮發(fā)性氣味物質(zhì)種類均高于梨花，共含有氣味物質(zhì)23種，其中花藥中含16種、花蜜中含5種；2種花中均是花藥比花蜜氣味物質(zhì)更豐富。

表1 梨、油菜揮發(fā)性氣味物質(zhì)成分及相對含量%

續(xù)表1

梨花中相對含量最高的是十二甲基環(huán)六硅氧烷、乙醇和苯甲醛。油菜花中相對含量多的是苯丙腈、十二甲基環(huán)六硅氧烷和5-氰基-1-戊烯。

2.2 梨花、油菜花揮發(fā)性氣味物質(zhì)分類及比例分析

將梨花、油菜花中揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行歸類，由圖1～2可知，梨中氣味物質(zhì)有氧烷類、醛類、酯類、醚類、醇類5類，氧烷類占44%以上，油菜花中最多的酯類物質(zhì)梨花中沒有檢測到。油菜中氣味物質(zhì)有10類，分別是酯類、氧烷類、腈類、硫醚、醛類、酸類、碳氧化物、醇類、烯類、氰化物，占比最多的是酯類和氧烷類。

圖1 梨花揮發(fā)性氣味物質(zhì)比例分布圖

圖2 油菜揮發(fā)性氣味物質(zhì)比例分布圖

2.3 梨花、油菜花揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分分析

2.3.1 各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化處理 為防止所測數(shù)據(jù)在量綱和數(shù)量級上的差別對主成分分析造成影響，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理，使所測數(shù)據(jù)具有可比性。數(shù)據(jù)處理方式依據(jù)式(1)進(jìn)行。

2.3.2 梨花朵揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分分析 從表2可以看出，第1主成分和物質(zhì)1、2、6、7、8、9呈正相關(guān)，主要為氧烷類、酯類、腈類、醚類，和苯甲醛呈負(fù)相關(guān)，主要貢獻(xiàn)物為二甲基硫醚、十四甲基環(huán)七硅氧烷、苯丙腈、二氧化碳、乙醇、苯甲醛。第2主成分和十二甲基環(huán)六硅氧烷呈正相關(guān)，其也是第2主成分主要貢獻(xiàn)物。第1成分的貢獻(xiàn)率為75.98%，第2成分的貢獻(xiàn)率為24.02%。2個成分的累計貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到100%，說明該數(shù)據(jù)的變化趨勢符合分析要求。

表2 梨花花朵揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分載荷矩陣

2.3.3 油菜花朵揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分分析 從表3中可以看出，第1主成分和物質(zhì)8、9、10、19、22呈正相關(guān)，主要為醛類、氧烷類、烯類、酯類等物質(zhì)；和5、17、18呈負(fù)相關(guān)，主要為酯類、腈類和醚類；主要貢獻(xiàn)物為反-2-己烯醛、異硫氰酸-2-苯乙酯、4-異硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚和十八甲基環(huán)九硅氧烷。第2主成分與物質(zhì)2、6、11、14呈正相關(guān)，主要為醇類、醛類和氧烷類；與物質(zhì)15、16、20、21呈負(fù)相關(guān)，主要為酸類、醚類和酯類物質(zhì)；主要貢獻(xiàn)物為乙醇、甲基烯丙基氰化物、辛酸、癸酸甲酯和二甲基四硫醚。第1成分的貢獻(xiàn)率為51.523%，第2成分的貢獻(xiàn)率為48.477%。2個成分的累計貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到100%，因此該數(shù)據(jù)的變化趨勢能較好地反映原始信息，符合分析的要求。

表3 油菜花花朵揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分載荷矩陣

2.4 梨花、油菜花氣味物質(zhì)與傳粉昆蟲相關(guān)性分析

傳粉昆蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)試驗地共有傳粉昆蟲4目10科11種，但梨和油菜傳粉昆蟲數(shù)量有顯著差異(P<0.05)。梨樹平均每天有傳粉昆蟲20只，油菜每天平均有196只。將梨、油菜花朵所含揮發(fā)性氣味物質(zhì)成分與傳粉昆蟲數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，并未發(fā)現(xiàn)各種成分與昆蟲數(shù)量呈顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

異花授粉植物與傳粉昆蟲協(xié)同進(jìn)化的過程中，通過花朵形態(tài)、顏色、大小、氣味、分泌花蜜、散發(fā)花粉等方式來吸引傳粉昆蟲，其中除了花蜜、花粉等食物報酬的因素，一些昆蟲主要通過嗅覺而不是視覺吸引進(jìn)行傳粉[24]，不同的傳粉昆蟲對氣味敏感度也有很大差異[25]。油菜花氣味物質(zhì)成分種類和數(shù)量均比梨花豐富很多，可能是吸引更多傳粉昆蟲的原因之一。而且不論是油菜花還是梨花，大多數(shù)氣味物質(zhì)都是由花藥提供，說明花藥是花朵氣味的主要來源。

本研究表明，油菜花中含量及比例較高的揮發(fā)性化合物是氧烷類、酯類及苯丙腈，氣味貢獻(xiàn)物主要來自于反-2-己烯醛、異硫氰酸-2-苯乙酯、4-異硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚等化合物；梨花中含量及比例較高的是氧烷類、乙醇、苯甲醛，氣味貢獻(xiàn)物主要來自于二甲基硫醚、十四甲基環(huán)七硅氧烷、苯丙腈、苯甲醛等化合物。有研究表明，苯乙醛對鱗翅目昆蟲具有引誘性[26]，苯甲醛是一種廣泛存在于蜜源植物中的揮發(fā)性化合物，但其對金斑蝶的吸引力要顯著弱于桉樹腦、α-蒎烯等化合物[27]，芳香族化合物可以吸引傳粉昆蟲[10]，說明揮發(fā)性化合物在吸引傳粉昆蟲中發(fā)揮了重要作用。但各種氣味成分相互作用是一個較為復(fù)雜的過程，而且氣味物質(zhì)成分與溫度、濕度、光照、水肥管理、栽培條件以及品種等多種因素有關(guān)，因此李中珊[28]所測梨花氣味物質(zhì)與本研究差異較大。

梨花是異花授粉作物，但訪花昆蟲數(shù)量較油菜花極少。梨花和油菜花氣味物質(zhì)中含有5種共有物質(zhì)，梨花中另有4種氣味物質(zhì)是油菜花中未檢測到的，梨花中的這4種氣味物質(zhì)是否對傳粉昆蟲具有趨避作用，還是由于相較于油菜，梨花花蜜分泌較少，從而導(dǎo)致梨花傳粉昆蟲數(shù)量少，這些仍然需要后續(xù)開展深入的研究進(jìn)一步驗證。

傳粉昆蟲通過嗅覺感知蜜粉源植物的存在并進(jìn)行采集，這對于異花授粉作物的結(jié)實至關(guān)重要。本研究比較了梨和油菜花的揮發(fā)性氣味物質(zhì)并分析了2種作物揮發(fā)性氣味物質(zhì)的差異，研究結(jié)果可為解決梨樹授粉中存在的難以吸引傳粉昆蟲的問題，找出對昆蟲有吸引力的氣味物質(zhì)，進(jìn)而通過噴施化學(xué)物質(zhì)來達(dá)到吸引更多昆蟲的目的提供一定的研究思路。