利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠腦片NMDA電流的研究*

黃燕云， 高 潔， 張利娜， 杜相欣， 張雨彤， 郭 霞， 郝 娜， 李建國(guó)， 張 宇△

(1. 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系， 太原 030001)

膜片鉗技術(shù)在1976年由德國(guó)科學(xué)家Nether和Sakmann 發(fā)明，他們首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)記錄到乙酰膽堿激活的單通道離子電流[1]。這種技術(shù)通過(guò)記錄細(xì)胞膜上單個(gè)或幾個(gè)離子通道開(kāi)放或關(guān)閉引起的電流變化來(lái)研究細(xì)胞生理功能，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，尤其是神經(jīng)科學(xué)的許多方面。如記錄在腦內(nèi)功能活動(dòng)時(shí)神經(jīng)元興奮性的變化，神經(jīng)信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，神經(jīng)環(huán)路中突觸的傳遞過(guò)程等研究中[2-6]。全細(xì)胞記錄模式下可以獲得細(xì)胞膜上所有離子通道的綜合特性，能夠揭示細(xì)胞的電生理狀態(tài)，進(jìn)而為研究細(xì)胞之間信號(hào)傳遞提供有力的參考信息[7]。由于膜片鉗實(shí)驗(yàn)在操作時(shí)存在一定的技術(shù)難度，初學(xué)者在實(shí)驗(yàn)時(shí)總是會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題，需要一些經(jīng)驗(yàn)交流。因有關(guān)膜片鉗技術(shù)的原理和應(yīng)用在文獻(xiàn)和書籍中多有展示，本文將不復(fù)贅述，這里主要將筆者記錄腦片NMDA電流時(shí)的一些經(jīng)驗(yàn)體會(huì)在這里與大家分享。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取出生2～3周的雄性SD大鼠(購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，飼養(yǎng)在溫度為(23±1)℃，濕度(50±5)%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，12 h～12 h晝夜循環(huán)光照的動(dòng)物房?jī)?nèi)，大鼠領(lǐng)養(yǎng)后在實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)3 d后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

NMDA受體激動(dòng)劑NMDA(Abcam公司)，NMDA受體拮抗劑AP-V(Abcam公司)、非NMDA受體(AMPA/KA)拮抗劑CNQX(Abcam公司)、GABA受體拮抗劑Bicuculine(碧云天公司)、NaHCO3、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、HEPES、Glucose、EGTA、K-Gluconate、Na2-phosphocreatine、Na2-ATP、Na3-GTP和Mg-ATP產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司，帶芯微電極玻璃管GBF150-86-10HP產(chǎn)自美國(guó)Sutter公司，一次性使用針灸針0.35mm × 68mm (批號(hào)121160120)產(chǎn)自北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。

1.3 誘發(fā)腦片神經(jīng)元NMDA電流的方法

1.3.1 配置誘導(dǎo)NMDA電流的灌流液： NMDA灌流液(內(nèi)含100 μmol/L NMDA的孵育液)

1.3.2 自制誘導(dǎo)NMDA電流的刺激電極：將兩根針灸針(直徑0.35 mm，長(zhǎng)68 mm)刷上絕緣漆，晾干后用砂紙打磨掉兩尖端的絕緣漆，等高并排固定于熱縮管中，兩尖端平行間隔約1 mm左右，從電極尾部分別引出2根導(dǎo)線連接至隔離器，然后將刺激電極固定于一鉛筆粗細(xì)的塑料桿上，夾持于微操送達(dá)至目標(biāo)區(qū)域附近(圖1)。

Fig. 1 A homemade stimulation electrode

1.4 試劑配制

對(duì)于出生2～3周的未成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，離體腦組織可用含蔗糖的ACSF。

切片液蔗糖ACSF配方(mmol/L)： NaHCO326，KCl 2.5，NaH2PO41.25，CaCl20.5，MgSO47，HEPES 5，Glucose 10，Sucrose 210，滲透壓為300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

孵育液配方(mmol/L)： KCl 2.5，CaCl22，NaH2PO41.25，NaCl 124，NaHCO326，Glucose 10，滲透壓為300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

電極內(nèi)液配方(mmol/L)： K-Gluconate 120，KCl 5，HEPES-K 10，EGTA 5，CaCl20.5，MgSO42，Na2-phosphocreatine 5，Na2-ATP 5，Na3-GTP 4，Mg-ATP 4，滲透壓為290～300 mmHg，pH 7.35～7.45。

1.5 組織切片制備

切片液，孵育液均需提前通入混合氣(95% O2+ 5% CO2)至飽和。取切片液200 ml左右，置于孵育盒中預(yù)先冰凍至冰水混合狀(內(nèi)含小冰晶)，另取一個(gè)孵育盒倒入適量孵育液室溫放置并持續(xù)通氣。用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后斷頭，快速取腦組織放到提前準(zhǔn)備好的冰凍切片液中。培養(yǎng)皿中放濾紙，滴加切片液，腦組織放在濾紙上，吸干水分的同時(shí)用刀片修整腦組織，切取實(shí)驗(yàn)需要部位，周圍用溶好的瓊脂包埋，切片厚度為200～300 μm。切片過(guò)程中持續(xù)通氣。腦片切出后立刻轉(zhuǎn)移至ACSF中，室溫孵育1 h即可記錄。

1.6 腦片膜片鉗記錄方法

制備好大鼠腦片后，在全細(xì)胞模式下進(jìn)行電生理記錄。用水平電極拉制儀(P-97，Sutter Instrument Co，Novato，CA)將硼硅酸鹽玻璃電極拉伸(電阻最好小于6 MΩ)。取一腦片置于浴槽中，用蓋網(wǎng)將其壓住。封接前先在低倍物鏡下找到腦片中的所需細(xì)胞，然后在高倍浸水物鏡下，通過(guò)圖像采集軟件觀察鏡下胞體形態(tài)、軸突走行。選擇合適的目標(biāo)細(xì)胞后，在電腦屏幕上標(biāo)記定位。在低倍物鏡下通過(guò)微電極操縱器調(diào)整玻璃電極的位置，并使其帶有正壓入水，記錄入水電阻；在高倍浸水物鏡下，通過(guò)圖像采樣逐步引導(dǎo)電極到達(dá)細(xì)胞中。在可視條件下，結(jié)合記錄軟件提供的電極阻抗圖形，適時(shí)釋放正壓，并輕施負(fù)壓，借助鉗制膜電位水平獲得高阻抗(GΩ級(jí))封接，成功破膜后即可形成全細(xì)胞記錄方式。通過(guò)膜片鉗放大器(Axopatch 200B，USA)收集數(shù)據(jù)，膜電流以10 kHz數(shù)字化，以2 kHz下濾波，并存儲(chǔ)在個(gè)人計(jì)算機(jī)中用于隨后的分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 記錄大鼠腦片神經(jīng)元的EPSC和AP

制備好腦片后，選擇前扣帶皮層吻側(cè)部(rostral anterior cingulate cortex, rACC)腦區(qū)合適的神經(jīng)元進(jìn)行記錄。破膜后，在電壓鉗模式下，將細(xì)胞鉗制在-60 mV下，記錄神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)，興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current, EPSC)，而后在電流鉗模式下，I=0時(shí)記錄神經(jīng)元的動(dòng)作電位(action potential, AP)。此步可在正式記錄前判斷神經(jīng)元的狀態(tài)(圖2)。

Fig. 2 A showed the recorded EPSC on a neuron, B showed the AP

2.2 直接灌流含NMDA孵育液與給予電刺激誘發(fā)NMDA電流幅度的比較

本文比較了在灌流液中直接給予激動(dòng)劑NMDA與自制刺激電極兩種方式來(lái)誘發(fā)NMDA電流。選擇rACC腦區(qū)的神經(jīng)元，將其鉗制在+40 mV，通過(guò)重力給藥系統(tǒng)灌流NMDA(100 μmol/L)得到的電流，給予NMDA受體拮抗劑AP-V(50 μmol/L)后，電流受到明顯抑制，孵育液洗脫后電流幅度明顯恢復(fù)(圖3A)；刺激電極給予電壓3 V，間隔10 s發(fā)放一次刺激誘發(fā)的電流，給予NMDA受體性拮抗劑AP-V(50 μmol/L)后，電流受到明顯抑制，孵育液洗脫后電流恢復(fù)(圖3B)。實(shí)驗(yàn)證明二者誘發(fā)的電流都為NMDA電流，且二者誘發(fā)的NMDA峰值電流幅度分別為NMDA組(282.0±24.3)pA VS 自制刺激電極組(261.4±40.1)pA，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異(P>0.05，n=4)。

Fig. 3 Comparison of two ways to generate NMDA currentsA: The curves of the induced NMDA current were shown after an agonist NMDA (100 μmol/L) administration; B: The curves of the excited NMDA current were shown after electrical stimulation

2.3 兩種刺激電極誘發(fā)的NMDA電流幅度的比較

自制刺激電極通過(guò)利用一次性使用針灸針改造而成，為了檢測(cè)自制刺激電極的可靠性，將其與進(jìn)口刺激電極進(jìn)行了對(duì)比。每組腦片均在rACC腦區(qū)選擇大小形態(tài)類似的神經(jīng)元各4個(gè)，記錄給予電刺激前后NMDA電流的變化。刺激電壓3 V，間隔10 s發(fā)放一次刺激。結(jié)果顯示兩種刺激電極誘發(fā)的NMDA電流幅度大小分別為進(jìn)口刺激電極組(267.2± 36.5)pA VS自制刺激電極組 (239.2±41.0)pA，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4，n=4)。

Fig. 4 Comparison to the NMDA currents were respectively stimulated at +40 mV potential by an electrode from abroad (A) and a homemade one (B) in incubation fluid withBicuculine (100 μmol/L) and CNQX (20 μmol/L)

3 討論

與單細(xì)胞膜片鉗相比較，腦片膜片鉗有前者無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。由于腦片中保存了部分的神經(jīng)纖維聯(lián)系，它在一定程度上為神經(jīng)元提供了接近生理狀態(tài)下的環(huán)境，這樣記錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更接近于真實(shí)。另外，在腦片上確定目標(biāo)神經(jīng)元，也從視覺(jué)上可以識(shí)別或明確它在大腦中的具體位置。

目前全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種器官或細(xì)胞的科學(xué)研究[8,9]，例如心肌成纖維細(xì)胞以及腦片神經(jīng)元，但對(duì)該技術(shù)掌握還有一定的難度。對(duì)于腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)，首要是保證腦片的活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：(1)年齡較大的動(dòng)物(4周齡以上)需先在30℃左右的混合液中孵育30 min，之后移到室溫的灌流液中孵育90 min，細(xì)胞的狀態(tài)較好，而鼠齡較小的，如小于3周的動(dòng)物切片后直接在室溫孵育1 h即可記錄。(2)腦片孵育過(guò)程中，氣流不應(yīng)過(guò)大，以免將腦片吹起，造成腦片翻滾；但氣流也不宜過(guò)小，過(guò)小會(huì)導(dǎo)致腦片供氧量不足；腦片之間切忌相互重疊，更不能讓氣泡直接接觸腦片。在腦片放入孵育盒后，也不要隨意移動(dòng)腦片的位置。(3)在孵育過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)腦片變白(正常應(yīng)為淡黃色)、腦片打卷不易舒展，說(shuō)明腦片活性較低。腦片變白可能為缺氧時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即混合氣中O2的比例偏低或氣流過(guò)小。腦片打卷可能是因?yàn)槟X片厚度較薄或厚薄不均勻所致。腦片不易舒展可能是孵育液的滲透壓不合適。(4)腦片孵育盒中的液體量不必太多，液面可沒(méi)過(guò)腦片3～5 mm高度即可，這樣既可以保證腦片的供氧，維持液體的pH，也不浪費(fèi)液體。

在給藥方式上，本研究先后嘗試了重力灌流給藥和局部微量給藥兩種方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，局部微量給藥的優(yōu)點(diǎn)是快速、節(jié)省試劑。該方法雖然可以快速將設(shè)定濃度的藥物送至靶細(xì)胞附近發(fā)揮作用，但是由于受到目標(biāo)細(xì)胞周圍組織的影響，藥物擴(kuò)散至細(xì)胞發(fā)揮作用的穩(wěn)定性不佳，因此局部微量給藥更適合急性分離或培養(yǎng)細(xì)胞的膜片鉗實(shí)驗(yàn)。重力灌流給藥具有藥物可對(duì)細(xì)胞充分作用、細(xì)胞有更穩(wěn)定反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，但是它有藥物發(fā)揮作用時(shí)間長(zhǎng)、比較浪費(fèi)昂貴試劑的缺點(diǎn)，而且由于藥物作用的影響，一張腦片只能記錄一個(gè)細(xì)胞在藥物干預(yù)前后的電流變化。

研究中在記錄NMDA電流時(shí)[10,11]，嘗試了電刺激誘導(dǎo)NMDA電流的方法。該方法具有細(xì)胞反應(yīng)快速、穩(wěn)定，節(jié)省試劑，避免了藥物灌流誘導(dǎo)電流時(shí)對(duì)腦片其它神經(jīng)元的影響，這樣一張腦片就可記錄多個(gè)神經(jīng)元的NMDA電流。實(shí)驗(yàn)中要注意需將刺激電極置于靠近目標(biāo)區(qū)域的位置。在實(shí)驗(yàn)初期因本實(shí)驗(yàn)室無(wú)刺激電極，就利用針灸針自制了刺激電極，成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定的NMDA電流。后期獲得了國(guó)外的刺激電極，其誘導(dǎo)出的NMDA電流與我們自制電極誘導(dǎo)的NMDA電流大小比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，自制的刺激電極也可以成功的誘發(fā)NMDA電流，自制的刺激電極具有更加方便、廉價(jià)、易獲得的優(yōu)點(diǎn)。刺激電極制作時(shí)要注意，兩根針灸針靠近的部位要刷絕緣漆，防止接入刺激器正負(fù)極時(shí)發(fā)生短路；而電極的尖端，即給腦片施加電刺激的尖端則要避免被絕緣漆包裹，正負(fù)極尖端之間的間隔大約1 mm。由于進(jìn)口刺激電極價(jià)格昂貴且不易購(gòu)買到，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多次嘗試摸索出一種自制腦片刺激電極的方法。通過(guò)自制電極誘發(fā)的NMDA電流與受體激動(dòng)劑誘發(fā)的電流以及進(jìn)口電極誘發(fā)的電流相比，結(jié)果高度一致且穩(wěn)定性好，說(shuō)明自制電極的制作是成功的。這為經(jīng)費(fèi)不很充足的實(shí)驗(yàn)室記錄NMDA電流或開(kāi)展類似實(shí)驗(yàn)提供了可行途徑。

隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，將膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)，尤其是一些新興技術(shù)相結(jié)合來(lái)解決科學(xué)問(wèn)題已是未來(lái)研究的趨勢(shì)。例如將膜片鉗與原子力顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、熒光探針、分子生物學(xué)技術(shù)等其他檢測(cè)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用。這些技術(shù)不僅提高了細(xì)胞電生理探測(cè)的分辨率及靈敏度，還可以同時(shí)獲取細(xì)胞的電生理信息和各種與之相對(duì)應(yīng)的力學(xué)或分子生物學(xué)信息，極大地彌補(bǔ)了膜片鉗技術(shù)檢測(cè)信號(hào)單一的缺點(diǎn)[12-14]。因此，膜片鉗技術(shù)仍然是生命科學(xué)研究中具有獨(dú)特作用的必備手段。