蔬菜疫病抗性鑒定技術研究進展

王 瑞，金慶敏，楊曉珊，吳廷全

（廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

疫霉菌屬（Phytophthorade Bary）卵菌，隸屬于藻界（Chromista）卵菌門（Oomycota）卵菌綱（Oomycetes）霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫 霉 屬（Phytophthora）［1］，是一群重要的植物病原菌，由該菌所致的植物病害通常稱為“疫病”，是一種毀滅性病害，主要危害的蔬菜作物有馬鈴薯、番茄、辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、芋頭等。疫霉菌在世界范圍內廣泛分布，可致被感染體壞死、軟腐和枯萎，造成植株成片枯死與毀滅，流行年份造成的損失輕則15%～30%，重達50%以上，甚至絕收［2］。特別是在華南地區(qū)春季低溫高濕、夏季高溫多雨的氣候條件下極易引起疫病暴發(fā)，給蔬菜生產造成較大經濟損失。目前對蔬菜疫病的防治主要以藥劑防治與栽培抗疫病或耐病品種相結合，但大量使用化學農藥，不僅易引起各種病原菌抗藥性增強，還會使蔬菜產品中農藥殘留增加，極大影響蔬菜品質和安全性，甚至造成環(huán)境污染，限制蔬菜產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3］。選育高抗疫病新品種是抵御蔬菜疫病最經濟、有效的途徑，而種質資源的抗病性鑒定和篩選是抗病育種的前提和保障，創(chuàng)建一項快速準確的鑒定技術體系是了解種質資源抗性的重要前提，也是抗病育種工作的重要工具。對于蔬菜疫病抗性育種工作，國內外學者在鑒定方法方面做了大量工作［4-8］，由于引起不同蔬菜產生疫病的疫霉菌種類不完全相同，因此，不同種類的蔬菜作物在疫病抗性鑒定方法上存在較大差異。另外，由于氣候條件、發(fā)病條件不同，研究方法也存在差異，同份材料不同地域的鑒定結果也存在較大差異。本文以茄果類（馬鈴薯、番茄、辣椒）、瓜類（黃瓜、冬瓜、西瓜）及芋類蔬菜為代表，對其疫病抗性鑒定方法進行全面總結，對目前存在問題進行分析，并對未來發(fā)展方向進行展望，旨在為蔬菜疫病抗性鑒定及抗疫病育種工作提供科學依據。

1 茄果類蔬菜疫病抗性鑒定方法

馬鈴薯、番茄、辣椒等是重要的茄科蔬菜作物，疫病是其最重要的病害之一。侵染馬鈴薯和番茄的致病疫霉均為Phytophthora infestans（Mont.）de Bary［8］，由此菌所致的病害稱為“晚疫病”。而侵染辣椒的疫霉菌為Phytophthora capsiciL［9］，由此菌所致的辣椒病害稱為“辣椒疫病”。在我國南方，茄果類蔬菜疫病發(fā)生嚴重，對茄科蔬菜產業(yè)的發(fā)展造成嚴重障礙。

1.1 馬鈴薯晚疫病抗性鑒定

目前，馬鈴薯抗疫病鑒定方面已有大量報道，主要方法為：（1）田間自然抗性鑒定法：即利用田間自然發(fā)病狀態(tài)進行抗病性鑒定，一般會選擇多年種地塊，選擇合適的發(fā)病氣候條件進行篩選鑒定。Stewart 等［10］比較了田間鑒定和溫室鑒定的關鍵影響因素，認為播種季節(jié)、接種苗齡和栽培密度影響馬鈴薯的田間抗性，如在春季鑒定比夏季鑒定更抗??；5～7 周苗齡接種比4 周苗齡時表現更抗??；栽培密度小比密度大更抗病。田祚茂等［11］利用田間鑒定法對709 份馬鈴薯種質資源進行抗性評價，篩選到84 份高抗材料、51份抗病材料、574 份感病材料。金光輝［12］對24個抗晚疫病的馬鈴薯品種進行田間抗性鑒定，研究不同抗性資源的抗性穩(wěn)定性和持久性，結果顯示某些品種的地上部莖葉抗病性與地下部塊莖抗病性不一致，莖葉抗性與塊莖抗性分別受控于不同基因。王鵬等［13］對來自全國38 份馬鈴薯品種（系）進行晚疫病抗性的田間鑒定，篩選出兩份田間抗性和豐產性較好的材料。唐建鋒等［14］對貴州12 個馬鈴薯品種的抗性及產量進行初步評價，發(fā)現參試品種抗性綜合評價為感病至高感。李威等［15］對10 個馬鈴薯品種抗晚疫病田間自然誘發(fā)鑒定，表現中抗的品種2 個，表現中感的3 個，表現感病的2 個，表現高感的3 個。

（2）離體葉片鑒定法：即采摘5～7 葉期無病斑葉片，背面朝上置于培養(yǎng)皿中，用移液槍吸取20 μL 游動孢子懸浮液接種在葉片背面，測量病斑面積，采用5 級分級標準進行評價。20 世紀60 年代，國外學者已建立葉片離體檢測法［5,8］，Vivianne 等［16］比較了離體葉片鑒定與田間鑒定及其他方法的有效性，指出離體葉片鑒定的感病程度高于田間整株鑒定。李華青［7］采用室內離體葉片接種法和室內成株接種法對100 份馬鈴薯種質資源進行晚疫病抗性評價，其中9 份高抗、15 份中抗、44 份抗、23 份感病、9 份高感，兩種方法鑒定結果基本一致。婁樹寶等［17］采用離體葉片法對49 個馬鈴薯栽培品種和13 個野生種進行室內晚疫病菌混合生理小種接種鑒定，49 個栽培品種中沒有發(fā)現高抗品種，其中7 個表現抗病，11 個表現中抗，18 個表現感病，而13 個野生種表現高感；對從國際馬鈴薯中心引進的資源及其后代進行抗性鑒定，從103 份材料中鑒定高抗材料8 份、抗病材料12 份，認為離體接種鑒定法更準確［18］。余小玲［19］采用離體接種法，對來自國內外370 份馬鈴薯育種材料進行多輪抗性鑒定，篩選出中抗及以上的晚疫病抗性材料50份。王洪洋等［20］利用離體葉片接種法對43 份馬鈴薯種質資源進行晚疫病抗性鑒定、比較和評價，鑒定出5 份高抗和14 份中抗種質資源材料。離體葉片接種法因易于操作，環(huán)境因素可控，應用比較廣泛，在病原菌與寄主互作相關研究方面大多采用該方法［21］。

（3）薯塊鑒定法：馬鈴薯晚疫病抗病性可分為植株抗性和塊莖抗性，地上植株與地下塊莖對晚疫病的抗病性表現并不一致［22-23］，僅對地上部分進行鑒定篩選，不能夠真實反映該資源的整體抗性。基于此，研究者開發(fā)了薯塊鑒定法。塊莖晚疫病抗性的鑒定可分為自然接種和人工接種方式兩類。人工接種法分為整薯接種法和塊莖薄片接種法。田振東等［24］發(fā)現塊莖薄片接種法要求無菌操作，易發(fā)生雜菌污染，導致薯片腐爛，影響鑒定結果，注射法接種效果最好。王仁貴等［25］認為整薯受傷接種法更加簡單、易操作。也有學者認為利用室內塊莖薄片鑒定法可以忽略薯皮對致病疫霉的抗性，更清晰反映薯塊抗性［26］。王騰［27］利用6 個不同生理小種類型對9 個晚疫病抗源材料進行塊莖抗性鑒定，共鑒別出3 個抗性品種，均表現中抗，且與3 個品種的植株抗性基本相同。敖翔等［28］利用5 個菌株對13 個無性系馬鈴薯材料進行晚疫病塊莖薄片法抗性鑒定，發(fā)現其中高抗1 份、中抗2 份、感病6 份、高感4 份。夏艷濤等［29］利用室內薯片接種鑒定法對黑龍江7個馬鈴薯主栽品種進行晚疫病抗性鑒定，結果5 個品種表現中抗，2 個品種表現感病，與田間發(fā)病抗性略有不同。

多數情況下，使用不同抗性鑒定方法鑒定相同材料，可以得出相同或相近結果。而少數情況下，使用不同抗性鑒定方法鑒定相同材料，會產生相異的鑒定結果，如果出現鑒定結果相異的情況，需采用多種方法聯合分析，最終鑒定種質資源的抗性。

1.2 番茄晚疫病抗性鑒定

番茄晚疫病與馬鈴薯晚疫病致病菌為不同生理小種的致病疫霉，其鑒定方法與馬鈴薯相似，目前常用的有田間自然發(fā)病鑒定法、苗期人工接種法和離體葉片接種法3 種［30］。（1）田間自然發(fā)病鑒定法：許多研究認為田間自然發(fā)病鑒定法是一種有效方法，但田間鑒定需要大量土地，環(huán)境條件不可控，每年只能鑒定1 次，受時間、環(huán)境影響，鑒定效率較低，因此不常用。蘇銀鈴等［31］對41 份番茄進行田間檢測3 種葉部病害，發(fā)現晚疫病發(fā)病最輕。劉夢姣等［32］利用田間鑒定和分子標記相結合的方法對廣西櫻桃番茄抗晚疫病進行鑒定，26 份櫻桃番茄材料對晚疫病表現出不同程度抗性，其中表現免疫的7 份、高抗的15 份、中抗的4 份。

（2）苗期人工接種法：在番茄4～6 片真葉期，用噴霧法接種晚疫病原菌孢子囊懸浮液，濃度為1.2×103～5×104個孢子囊/mL，接種后6～8 d 調查植株發(fā)病情況，分級標準采用5 級或6 級，該方法被證實與田間自然選擇有高度一致性［33-34］。程沄等［35］比較了噴霧法在苗期和成株期接種后的差異，發(fā)現苗期和成株期的抗病性基本一致。苗期接種法作為鑒定晚疫病的有效方法被研究者廣泛采用。毛愛軍等［36］采用苗期噴霧法對7 份雜交一代番茄品種和10 份自交系進行鑒定，發(fā)現7 份雜交一代品種高感，10 份自交系材料中有7 份高感、3 份耐病。智曉娜等［37］采用噴霧接種法對182 份野生種醋栗番茄進行篩選鑒定，有25份對T0.1 小種表現出穩(wěn)定的抗性，其中免疫1 份，高抗5 份，中抗19 份；對T1.2 小種表現出抗性的種質資源22 份，占12.09%，其中高抗種質3 份，中抗種質19 份。

（3）離體葉片接種法;與馬鈴薯離體接種法相似，采用6～7 葉期葉片，接種病原菌懸浮液于葉片背面主葉脈的兩側，接種濃度為1×103～5×104個孢子/mL，每葉片接種量為30 μL。張文淑等［38］利用幼苗期和成株期離體葉片噴霧法，鑒定了680 份番茄材料，未發(fā)現免疫型。張喜春等［39］采用葉片離體接種法對俄羅斯6 個番茄品種進行鑒定，結果表明番茄晚疫病最適的孢子囊懸浮液接種濃度為1×103個孢子囊/mL,最佳調查時間為接種后3～5 d。姜曉艷等［40］對番茄晚疫病人工接種技術進行了系統(tǒng)研究，采用孢子囊懸浮液噴霧法和離體葉片涂抹法對20 份番茄材料進行了抗病性鑒定，篩選出6 份抗病、3 份高抗材料，證實噴霧法和離體葉片涂抹法的鑒定結果基本一致。

1.3 辣椒疫病抗性鑒定

辣椒疫病由Phytophthora capsiciL.疫霉菌引起，首次由Leonian 于1922 年在新墨西哥州發(fā)現，抗性鑒定方法有：（1）灌根法：在苗齡5～7 葉期，植株根部接種孢子懸浮液1×104個孢子/mL，接種6 d 后調查發(fā)病情況，采用5 級分級標準統(tǒng)計病情。（2）離體葉片法：始花期的健康葉片接種2×104～3×104個孢子/mL 孢子懸浮液或者菌餅塊（病原菌在胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 后，用打孔器打出菌餅），以接種葉平均病級作為鑒定效果分析和抗性分級的指標。（3）傷莖法：在植株根部用手術刀或者牙簽將根部劃傷，再灌根接種。（4）莖葉噴霧法：采用苗期噴孢子懸浮液的方法。其中灌根法與田間發(fā)病情況最相似而被廣泛應用。吳麗萍等［41］采用灌根法對19 個辣椒資源進行鑒定，發(fā)現高抗材料19 個、抗病材料5 個。蓬桂華等［42］采用灌根法對30 份貴州辣椒品種進行鑒定，發(fā)現抗病材料1 份，中抗、中感及感病材料各9 份，高感2 份，周洋等［43-44］均采用灌根法對辣椒資源進行鑒定篩選。方文慧等［45］比較了灌根法、菌懸液接種葉片法及莖部貼菌法鑒定辣椒抗性，認為灌根法更加快捷、準確、方便且與病圃發(fā)病結果相似。易圖永等［46］比較了離體葉片接種法、切莖接種法及灌根接種法的優(yōu)缺點，發(fā)現3 種方法均能區(qū)分辣椒品種的抗感性，可根據需要選擇適宜的接種方法。但Kim 等［47］研究得出，對于致病力較弱的菌株，葉部噴霧法和傷莖法比灌根法更好。李智軍等［48］利用菌懸液接種離體葉片的方法鑒定辣椒，發(fā)現離體葉片接種法與灌根法和噴霧法兩種方法的吻合度分別為68.4%、76.3%。赫衛(wèi)等［49］建立了浸根法鑒定辣椒疫病的抗性，即在苗齡為5～6 片真葉期時采用浸根法接種，接種游動孢子懸浮液濃度為10 個孢子/mL，接種5 d 后調查發(fā)病率和病情指數，即可對辣椒品種進行抗性水平分級鑒定。

辣椒疫病抗性鑒定方法較多，辣椒疫病菌株也有小種分化現象，在方法選取時要考慮選取有代表性的菌株、接種苗齡、接種部位及環(huán)境條件的影響。

2 瓜類蔬菜疫病抗性鑒定方法

瓜類疫病的瓜類疫霉（Phytophthora melonisKatsura）可侵染黃瓜、冬瓜、節(jié)瓜、南瓜等瓜類作物。而西瓜和部分地區(qū)南瓜的疫病由Phytophthora capsiciL.引起。瓜類疫病是一種毀滅性病害，給瓜類生產造成巨大損失。由于缺乏抗源，相對于茄果類蔬菜抗性鑒定研究，瓜類的抗性鑒定方法研究較少。

2.1 黃瓜

20 世紀80 年代，國內學者開始瓜類疫病抗性鑒定的研究。翁祖信等［50］提出菌絲塊活體接種黃瓜幼苗的方法，即子葉展平期在子葉中央點一滴無菌水，將培養(yǎng)皿菌絲打孔，獲得0.2 cm 菌絲塊，將其放入水滴中，保濕24 h，3 d 后調查發(fā)病情況。1983 年又提出用孢子懸浮液接種活體黃瓜幼苗，在一片真葉期接種，在一片子葉和真葉中央接種孢子懸浮液50 μL，濃度為100 個孢子/mL，結果顯示接種子葉和真葉期抗病性表現基本一致［51］。2010 年黃瓜抗疫病鑒定技術規(guī)程則采用灌根法：在植株2～3 片真葉期，在根部附近接種2 mL 濃度為5×103個孢子/mL 的孢子懸浮液。接種后7～10 d 采用5 級病情分級法，進行抗性評價。柴喜榮等［52］利用灌根法對7 個不同黃瓜品種進行疫病的抗病性篩選，其中長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3 號為中抗品種；中農20 號、早青二號和津優(yōu)1 號為感病品種。王瑞等［53］利用菌塊離體接種法對40 份不同抗性的黃瓜材料進行鑒定，發(fā)現栽培黃瓜抗疫病材料極少，只有PE40、PE119、PE120、PE185等4 份材料具有抗性，90%材料為感病或高感。

2.2 南瓜

劉學敏等［54］研究了接種體和接種部位對南瓜疫病接種效果的影響，結果顯示，接種游動孢子濃度為5×103～1×104個孢子/mL，接種部位為葉柄時發(fā)病最快。周克琴等［55］比較灌根法、注入法、根部切傷法發(fā)現，最優(yōu)組合即在3片真葉期，利用注射法接種3 mL（1 250 個孢子/mL），保濕時間48 h，接種后72 h 調查，該方法鑒定結果與多年田間鑒定結果一致。陸杰等［56］采用根部接種和葉片接種相結合的方法，對112 份種質資源進行室內疫病抗性鑒定及評價，篩選獲得了高抗材料2 份，抗病材料3 份，中抗材料9 份，其余均為感病材料。

2.3 西瓜、冬瓜

王永琦等［57］在西瓜疫病鑒定法研究中對比了灌根法、注射法和噴霧法，發(fā)現注射法發(fā)病最快、發(fā)病率高，不宜做抗性鑒定；噴霧法鑒定抗病性與田間不符，而灌根法最能反映田間發(fā)病過程，能夠有效區(qū)分各品種抗性，確定接種濃度1×106個孢子/mL、接種時期為2 片真葉期、調查時間為接種后12～15 d 為宜。曾莉莎等［58］將灌根法與離體葉片接種法進行比較，明確了成株期離體葉片接種法鑒定冬瓜疫病抗性是可行的，并采用離體葉片接種法對23 份冬瓜品種和18 份節(jié)瓜品種進行抗病性鑒定,從中篩選了抗、耐疫病的冬瓜和節(jié)瓜品種。

瓜類疫霉菌相對其他疫霉菌難以誘導大量孢子囊，游動孢子不足難以滿足大批量材料鑒定需求，且游動孢子在水中游動非?？?，難以計算準確?；诖斯P者所在團隊建立了一套高效簡便的子葉離體接種方法［53］，能夠有效鑒定黃瓜資源的疫病抗性情況。即利用2 mm 直徑菌塊直接接種于離體子葉背面，置于有潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，保濕24 h 即可觀察表型，通過計算病斑大小快速鑒定瓜類材料的抗性。該方法具有簡單、快速、精準、高通量的特點，且適用性廣，能在多種瓜類作物上使用［53］。

3 芋頭疫病抗性鑒定

芋頭疫病是由Phytophthora colocasiae引起的最重要的芋頭病害之一。我國廣東地區(qū)芋頭栽培面積逐年擴大，芋頭疫病的發(fā)生也越來越嚴重，極大影響芋頭產業(yè)發(fā)展［59］。芋頭疫病抗性鑒定起初依靠田間自然發(fā)病，但田間鑒定除依賴于合適的發(fā)病環(huán)境條件外，還需充足的田塊，費時費力。為解決這些問題，研究者建立了實驗室快速檢測技術，但由于芋頭葉片具有疏水特性，活體檢測很難保證菌液停留在葉片上，為此Books等［60］建立了芋頭離體葉片鑒定疫病抗性鑒定技術，即取第2 嫩或第3 嫩的葉片，在搪瓷盤放2 層沙布，加適量滅菌水，將葉片平鋪于搪瓷盤中，在葉片上選4 個點，其中3 個點各滴20 μL 孢子懸浮液，每滴含50 個孢子，另一個點滴20 μL 滅菌水作對照。點樣后用塑料薄膜蓋住搪瓷盤保濕，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d 后測量病斑的直徑來評判植株抗性。后期芋頭疫病檢測大都采用該方法或少許改進。周清平等［61］采用Books 方法對39 個芋頭品種（品系）進行鑒定發(fā)現，8 個表現抗性，11 個表現中抗，20 個表現感病。莫俊杰等［62］在Books 方法上進行改進，即利用0.5 cm 菌塊接種離體葉片，效率更高，并對63 個芋頭品系進行鑒定，其中6 個表現抗病，9 個表現中抗，42 個表現感病，其余抗性不明確。

4 存在問題

4.1 抗性鑒定研究薄弱，缺乏系統(tǒng)性研究

長期以來，由于抗性研究材料限制，導致蔬菜疫病抗性鑒定研究較薄弱。除對茄果類馬鈴薯研究較深入外，其他蔬菜作物疫病抗性研究均缺乏系統(tǒng)性。從已有研究方法來看，不同地區(qū)對同一作物采用的鑒定方法都不同，主要表現在接種濃度、接種菌株、接種苗齡及接種部位。如馬鈴薯晚疫病菌存在A1、A2 兩種交配型，生理小種有幾十個［63］，辣椒疫病致病菌主要有3 個生理小種。不同地區(qū)不同優(yōu)勢菌株，即使是同樣菌株的致病力也存在差異，抗性鑒定時要考慮菌株的致病力，選用代表性菌株或者當地致病力強的菌株。對于接種苗齡，就目前已經發(fā)表的抗性鑒定方法看，同種作物研究者采用的苗齡也不相同，有的采用子葉期、幼苗期或者成株期，不同苗齡的抗性不同，鑒定結果也存在差異，因此相同資源用不同方法的鑒定結果也會存在差異。

4.2 評價標準不同，鑒定結果存在差異

雖然，馬鈴薯、番茄、黃瓜等在疫病鑒定方面都建立了鑒定技術規(guī)程，但實際工作中研究者仍采用不同的評價標準對其進行抗性鑒定。以番茄苗期抗性鑒定評價標準為例，行業(yè)標準采用0～6 級病情分級，抗性評價標準為5 級分別為免疫、高抗、抗病、中抗、感病、高感。蘇銀鈴等［31］采用0～9 級分級標準，抗病程度為高抗、抗病、中抗、感病、高感。劉夢嬌等［32］采用0～6 級分級標準，但是病斑面積與行業(yè)標準描述病斑面積差異明顯。無論是病情描述還是抗性分類都存在較大差異。評價標準的差異直接反映鑒定結果，因此研究者在開展鑒定工作時需要選擇合適的方法和評價標準，才能確定種質資源的真實抗性水平。采用統(tǒng)一的鑒定標準對于抗病育種工作尤為重要，只有利用統(tǒng)一的抗性評價體系才能充分了解不同種質資源的真實抗性水平，才能被育種工作者充分合理利用。

4.3 離體鑒定技術缺乏農業(yè)行業(yè)標準

離體鑒定方法在蔬菜疫病抗性鑒定工作發(fā)揮重要作用，其操作方便，可以保存鑒定植株，特別在病原菌與植物互作研究中被廣大研究者青睞。目前，僅有馬鈴薯建立了離體葉片鑒定技術規(guī)程行業(yè)標準［63］，其他作物均未建立離體葉片的鑒定技術標準。

5 展望

抗性鑒定工作是抗病育種過程中的重要環(huán)節(jié)和手段之一。目前，蔬菜疫病抗性鑒定工作已取得較大進步，但總體上還不夠完善，如不同鑒定方法的可比性、苗期和成株期抗性的相關性、苗期鑒定相關因素的綜合評價與分析等方面仍需要進一步研究、探討和完善。因此，針對不同蔬菜作物疫病的抗性鑒定工作，可以成立區(qū)域或者全國聯合攻關小組，對各因素進行全面系統(tǒng)研究，建立統(tǒng)一、規(guī)范的鑒定技術與評價體系。另外，加強蔬菜疫病分子生物學研究，開發(fā)有效的分子標記，利用分子輔助篩選與抗性鑒定技術相結合的抗性篩選技術和鑒定體系是抗性鑒定發(fā)展的方向。蔬菜疫病抗性鑒定技術是蔬菜疫病抗性育種的前提與保障，能夠加速蔬菜抗疫病育種進程，促進我國蔬菜產業(yè)長足發(fā)展。