超快速turn-on型ClO-熒光探針的合成及性能

劉艷玲

(呂梁學院化學化工系，呂梁 033001)

次氯酸(HClO)或次氯酸根(ClO-)是生物體中重要的活性氧(reactive oxygen species，ROS)之一[1-2]，在生物體的細胞、組織、器官中普遍存在，其存在有助于使入侵的細菌失活，抑制DNA復制，減少細胞組織的細菌污染，抑制傷口感染。生物體中的HClO或ClO-分為內(nèi)源性和外源性，內(nèi)源性HClO或ClO-由白細胞(包括巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞)中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)催化過氧化氫和氯離子反應(yīng)而生成；外源性的HClO或ClO-主要是水的氯化消毒產(chǎn)生(Cl2+H2O→HClO)，存在于生活飲用水、醫(yī)院等各種公眾場所的消毒液中[3-6]。最近2年來，受新冠疫情的影響，消毒液的使用增加了人們暴露于ClO-中的機會，接觸到的ClO-的濃度也隨之增大，而HClO或ClO-濃度異常(ρ≥1 g·L-1)則會引起體內(nèi)生物分子氧化，進而導致各種生理疾病，包括關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、肝硬化和癌癥[7-11]。

對與疾病相關(guān)物質(zhì)的原位檢測以及生命和化學反應(yīng)過程中一些精細和中間過程的快速和高分辨監(jiān)測，是目前生物學和化學面臨的重要科學問題?；谟袡C小分子的熒光探針具有低成本、結(jié)構(gòu)簡單、生物兼容性好、發(fā)光性能易調(diào)控、反應(yīng)機制易闡明等優(yōu)勢，同時，熒光探針體現(xiàn)出可視化、非破壞性、多層次成像等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)在細胞或活體中目標分子的實時、定位檢測，因此被廣泛應(yīng)用于生物學、環(huán)境學和醫(yī)學等領(lǐng)域。

依據(jù)熒光探針對分析對象的識別方式不同，熒光探針可分為傳統(tǒng)型熒光探針和反應(yīng)型熒光探針。傳統(tǒng)型熒光探針與分析對象通過非共價的相互作用(氫鍵、靜電作用、配位作用、疏水作用和范德華力等)相結(jié)合，進而改變熒光探針的熒光信號。與傳統(tǒng)型熒光探針相比，反應(yīng)型熒光探針憑借不可逆性、特異性和生物正交性等優(yōu)勢，提高了其對分析對象的選擇性和靈敏度[12]。近年來，識別HClO的反應(yīng)型熒光探針快速發(fā)展，按其識別機理主要可分為氧化脫肟基反應(yīng)[13-15]、氧化硫族化合物反應(yīng)[16-18]、氧化酰肼反應(yīng)[19-20]與氧化脫氫反應(yīng)[21-22]等。但熒光探針仍存在合成路線復雜、檢出限過高、抗干擾能力差等缺點，要實現(xiàn)熒光探針在細胞器中靶向檢測HClO或ClO-仍然是目前生物化學研究的重要內(nèi)容[23-25]。為此，我們以2，7-二溴-9-芴酮為原料，通過兩步反應(yīng)合成了一種新型的turn-on型熒光探針，并研究了其對ClO-的檢測性能。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有F-7000熒光分光光度計、U-3900紫外可見分光光譜儀、AB Triple TOF 5600 plus System氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Bruker AVANCE-600 MHz核磁儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、Zeiss LSM 880激光掃描共聚焦顯微鏡。所需要的藥品和試劑均采購于上海阿拉丁試劑公司。

1.2 合成及表征

探針的合成路線如Scheme 1所示。將化合物2，7-二溴-9-芴酮(338 mg，1 mmol)和苯酚(940 mg，10 mmol)加入甲磺酸(5 mL)溶液中。將混合物在60℃攪拌6 h，冷卻，倒入水中層析并過濾后，用乙醇洗滌，得到白色固體化合物1(414 mg，82%)。

將1 g化合物1加入三氟乙酸(TFA)15 mL，然后再加入六次甲基四胺0.4 g，加熱至70℃，反應(yīng)6 h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，將所得混合物加入冰水中，用二氯甲烷萃取，以碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用二氯甲烷和石油醚(1∶5，V/V)進行柱色譜純化，得到的產(chǎn)物為白色固體化合物2，即為目標探針(900 mg，81%)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ 10.83(s，2H)，10.16(s，2H)，7.95(d，J=8.0 Hz，2H)，7.64(d，J=8.0 Hz，2H)，7.56(s，2H)，7.39(d，J=8.5 Hz，2H)，7.25(s，2H)，6.98(d，J=8.6 Hz，2H)。13C NMR(151 MHz，DMSO-d6)：δ 191.59，160.55，152.95，138.11，136.50，135.14，131.74，128.84，127.23，123.52，122.30，121.92，118.65，64.02(圖 S1～S3，Supporting information)。ESI-MS m/z：[M-H]-計算值 562.932 2，實測值562.932 6。

Scheme 1 Synthetic route of probe 2

2 結(jié)果與討論

通過實驗我們確定了探針識別反應(yīng)的最佳條件：磷酸緩沖鹽溶液(PBS，20 mmol·L-1，pH=7.4)和乙腈的混合溶液(1∶1，V/V)，激發(fā)波長為410 nm，發(fā)射波長為511 nm，激發(fā)狹縫寬度/發(fā)射狹縫寬度為5 nm/5 nm。以下相關(guān)實驗均在此反應(yīng)條件下進行。

2.1 探針識別ClO-的pH條件

首先，我們研究了不同pH值(2～6)和生理環(huán)境(pH=7.4)條件下，探針2對ClO-的光學響應(yīng)。如圖1所示，在pH=2～6的體系中，探針2在加入ClO-前后其熒光強度幾乎沒有變化，而在生理條件下，加入ClO-后2的熒光強度變化很大，故該探針適合在生理條件下檢測ClO-。

圖1 存在和不存在ClO-時pH對探針2的熒光的影響Fig.1 pH effect on fluorescence of probe 2 in the absence and presence of ClO-

2.2 探針識別ClO-的選擇性

接下來，我們選擇了一些人體中常見的分子和離子，如K+、Na+、NO2-、Br-、F-、Cl-、HSO3-、SO32-和生物硫醇 Cys(半胱氨酸)、Hcy(同型半胱氨酸)、GSH(谷胱甘肽)，以及具有氧化性的H2O2作為分析物，所加分析物濃度都是ClO-濃度的2倍，且與探針2的共存時間為5 min(ClO-的反應(yīng)時間為10 s)，結(jié)果見圖2。由圖可知，探針2對ClO-有明顯的選擇性檢測作用，其他分析物和2共存時對其熒光基本沒有影響。

圖2 探針2對ClO-的選擇性檢測Fig.2 Selective detection of ClO-by probe 2

2.3 探針識別ClO-的光譜研究

向探針2的PBS/乙腈溶液中逐漸加入濃度為0.1 mol·L-1的 ClO-溶液(每次 50 μL)，其 UV-Vis吸收光譜的變化見圖3?？梢钥闯?，隨著ClO-溶液濃度的增大，410 nm處的吸收峰逐漸增大，當加入的ClO-溶液總體積為150 μL后，吸收峰不再發(fā)生變化(圖S4)。而在320和340 nm處的吸收峰是隨著ClO-溶液濃度的增大而逐漸減小的。

圖3 ClO-濃度對探針2的UV-Vis光譜的影響Fig.3 Effect of ClO-concentration on UV-Vis spectra of probe 2

向探針2的PBS/乙腈溶液中逐漸加入濃度為0.1 mol·L-1的 ClO-溶液(每次 0.5 μL)，其熒光光譜的變化如圖4所示。由圖可見，隨著ClO-溶液濃度的增大，探針2在511 nm處的發(fā)射峰強度逐漸增大，當ClO-溶液加入量超過2.5 μL后，發(fā)射峰強度不再發(fā)生變化(圖 S5)。

圖4 ClO-濃度對探針2熒光強度的影響Fig.4 Effect of ClO-concentration on fluorescence intensity of probe 2

2.4 探針識別ClO-的動力學、檢出限和響應(yīng)機理

用熒光光譜法研究探針2識別ClO-的反應(yīng)時間，結(jié)果如圖 5所示。當 10 μmol·L-1的探針溶液和125 μmol·L-1的 ClO-溶液反應(yīng)，反應(yīng)在 10 s內(nèi)即完成，10 s后熒光強度不再變化。而且從圖中可以看出，空白實驗中探針很穩(wěn)定，其熒光強度基本不變。

在 10 μmol·L-1的探針體系中逐次加入 0.5 μL濃度為 0.1 mol·L-1的 ClO-溶液，使其濃度為25～125 μmol·L-1，用熒光強度對 ClO-溶液濃度作圖(圖6)，對數(shù)據(jù)進行線性擬合，求其斜率k，根據(jù)文獻[9]計算檢出限LOD，其值為0.74 μmol·L-1。

通過高分辨質(zhì)譜研究了探針2對ClO-的響應(yīng)機理。如圖S6所示，當探針和ClO-反應(yīng)完畢后，我們通過高分辨質(zhì)譜找到了響應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，該產(chǎn)物可認為具有苯醌結(jié)構(gòu)，我們推測可能的機理是ClO-將探針氧化成苯醌的結(jié)構(gòu)從而導致熒光強度增大。

2.5 探針識別ClO-的細胞成像

通過激光共聚焦顯微鏡考察了探針2在Hela細胞內(nèi)對 ClO-的響應(yīng)。用 10 μmol·L-1的探針孵育Hela細胞 20 min后，加入50 μmol·L-1的ClO-溶液繼續(xù)孵育。隨后用PBS洗滌細胞3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖7所示，綠色通道有明顯的綠色熒光。當我們用脂多糖(LPS)刺激細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的ClO-，也會有綠光出現(xiàn)。因此，我們的探針可以在細胞內(nèi)檢測內(nèi)源性和外源性的ClO-。

圖7 探針2在Hela細胞內(nèi)對ClO-響應(yīng)的熒光成像圖Fig.7 Fluorescence images of probe 2 responding to ClO-in Hela cells

3 結(jié)論

本研究提供了一種在生物體系中快速檢測ClO-的方法，該方法對ClO-有單一選擇性，熒光強度明顯，10 s內(nèi)快速完成反應(yīng)，且檢出限低至0.74 μmol·L-1。此外，探針還可以在HeLa細胞中實現(xiàn)ClO-的熒光成像，為今后ClO-的實時檢測提供了有價值的參考。

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