NLRP3炎癥小體及其在支氣管哮喘中的研究進展

韓艷奇，高志丹，黃翠萍

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院護理學(xué)院)

哮喘的特點是氣道炎癥、氣道重塑以及氣道高反應(yīng)性，如何有效治療哮喘中的炎癥對于良好的哮喘預(yù)后至關(guān)重要。炎性小體是細胞內(nèi)含有的多蛋白復(fù)合物，控制Caspase-1的活化，在炎癥和先天免疫中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的證據(jù)[1-2]分析顯示NLRP3炎性小體參與了哮喘等氣道疾病的炎癥過程。我們對炎癥小體在氣道炎癥中的作用做一綜述。

1 NLRP3結(jié)構(gòu)

所有的炎性小體中，NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組分，主要由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，在機體的免疫反應(yīng)中以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。

1.1 NLRP3蛋白

NLRP3屬于NLRPs亞家族。NLRPs超家族的基本功能結(jié)構(gòu)域由3種序列組成，包括氨基末端的PYD結(jié)構(gòu)域，中間的NHCAT核苷酸寡聚域，以及碳末端富含亮氨酸的LRR結(jié)構(gòu)域。NLRP3的特點是其N端的PYD結(jié)構(gòu)域與ASC蛋白的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，從而促進pro-caspase-1募集形成炎性小體復(fù)合物，即NLRP3-ASC-Caspase1。

1.2 接頭蛋白ASC

1999年，Masumoto等[3]在白血病細胞中發(fā)現(xiàn)了ASC分子，其分子量大小為22kDa，在多種巨噬細胞中均有較高水平的表達。在正常狀態(tài)的細胞中，ASC可以作為可溶蛋白存在于細胞核以及細胞質(zhì)中[4]。在細胞程序性死亡時，ASC會在細胞質(zhì)中聚集成中空的斑點樣，故又稱其為凋亡相關(guān)斑點樣蛋白。ASC是NLRP3炎性小體的接頭蛋白，由PYD和CARD兩部分構(gòu)成，在炎性小體的激活過程中，ASC從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿中形成ASC斑點，并最終形成炎性小體復(fù)合物。

1.3 效應(yīng)蛋白Caspase-1

Caspase-1又稱IL-1β轉(zhuǎn)化酶，是一種細胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶，它能夠啟動或執(zhí)行細胞程序，引發(fā)細胞因子誘導(dǎo)的炎癥或炎癥性受體介導(dǎo)的通路[5]。Caspase-1通過結(jié)合TLR激活MyD88/NF-κB介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)pro-IL-1β、pro-IL-18基因的表達和無活性的pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白的合成，IL-1β和IL-18的前體裂解為有生物活性的細胞因子分泌到細胞外。IL-1β控制著發(fā)燒、疼痛、血管擴張以及低血壓基因的表達，IL-1釋放以后可以對內(nèi)皮細胞作出反應(yīng)，促進免疫細胞向感染或受損組織浸潤。IL-18是形成干擾素γ所必須的細胞因子，它是一種介導(dǎo)著適應(yīng)性免疫反應(yīng)的協(xié)同刺激細胞因子。Caspase-1可通過炎癥小體誘導(dǎo)的自催化模式被激活。活化的Caspase-1可以裂解細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，使他們形成具有生物活性的形式，即IL-1β和IL-18?；罨腸aspase-1還能裂解gasdermin D(GSDMD)，使GSDMD的n端結(jié)構(gòu)域在質(zhì)膜上形成孔，從而觸發(fā)裂解的促炎癥形式的細胞死亡，稱為焦亡[6-7]。細胞焦亡是一種形態(tài)學(xué)變化不同于凋亡、壞死等細胞死亡的形式，其特征是caspase-1介導(dǎo)的細胞腫脹和裂解，導(dǎo)致細胞膜完整性喪失，促使大量促炎介質(zhì)釋放。光鏡下焦亡細胞表現(xiàn)為細胞腫脹膨大，并且有許多氣泡狀突出物。相對壞死細胞而言，細胞焦亡的腫脹程度更低；電鏡下，可以清楚看到在細胞質(zhì)膜破裂前，焦亡的細胞形成大量小泡，即焦亡小體，之后細胞膜上會形成孔隙，細胞膜破裂，內(nèi)容物流出[8]。

2 NLRP3炎性小體的激活機制

炎性小體的激活是導(dǎo)致疾病發(fā)生炎癥反應(yīng)的主要途徑之一，NLRP3炎性小體的激活不是直接識別、激活活化的簡單模式完成的，而是通過感知細胞內(nèi)環(huán)境紊亂的方式，為其活化做準(zhǔn)備。相關(guān)資料[9]顯示，已有多種細胞信號被提出能夠激活NLRP3炎性小體，其激活方式主要由2種信號完成，第一種信號為啟動信號，第二種信號為ATP，病毒RNA等刺激引發(fā)的激活信號。

2.1 NLRP3炎性小體的啟動階段

啟動信號主要是促使NLRP3蛋白表達升高，此為NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵步驟，其高表達能夠促進炎癥小體的活化。研究顯示[10]，NLRP3炎性小體的啟動階段主要依賴于不同的刺激因子，通過激活NF-κB誘導(dǎo)NLRP3和pro-IL-1β表達。還有相關(guān)研究[3，11]指出，炎性小體活化的起始階段不是通過上調(diào)NLRP3基因表達途徑完成的，如細菌脂多糖(LPS)激活TLR4/MyD88信號，導(dǎo)致NLRP3去泛素化，該過程依賴于線粒體中產(chǎn)生的活性氧(ROS)，進一步加快了NLRP3炎性小體活化的啟動信號。因此，起始階段對炎性小體活化的調(diào)節(jié)作用依賴于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾兩個方面。

2.2 NLRP3炎癥小體的激活

考慮到NLRP3激活物的化學(xué)和結(jié)構(gòu)多樣性，NLRP3不太可能與它的激活物發(fā)生物理作用。相反，NLRP3很可能感知到一種共同的細胞信號，從而對NLRP3激活物做出反應(yīng)，促進IL-1β和IL-18的活化，進而發(fā)揮一系列炎癥作用。一些分子被認為是NLRP3炎癥小體激活的觸發(fā)因素，包括K+外流、Ca2+信號、活性氧(ROS)、線粒體功能障礙和溶酶體破裂。

2.2.1 溶酶體依賴途徑

溶酶體既能分解外界進入細胞內(nèi)的物質(zhì)，也能消化內(nèi)源性的大分子。顆粒物通過內(nèi)吞作用激活NLRP3炎性小體，破壞溶酶體膜，導(dǎo)致蛋白酶家族溶酶體半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B釋放到胞質(zhì)中。據(jù)報道[6]溶酶體組織蛋白酶B的釋放對IL-1的釋放是必需的，但對IL-1前體細胞的生成不是必需的，結(jié)果指出組織蛋白酶B參與了NLRP3炎癥小體的激活。

2.2.2 離子通道依賴途徑

研究分析[12]，細胞內(nèi)K+外流以及細胞外Ca2+內(nèi)流都能促使NLRP3炎性小體活化。目前認為，離子流變化使炎性小體活化的機制主要與細胞內(nèi)離子濃度的變化有關(guān)，離子濃度的變化使NLRP3的構(gòu)象發(fā)生了改變，使PYD結(jié)構(gòu)域暴露，導(dǎo)致其與下游的NLRP3炎性小體效應(yīng)分子發(fā)生作用，進一步激活了NLRP3炎性小體。高濃度的K+外流可阻斷NLRP3炎癥小體的激活，但并不能阻斷AIM2(absent in melanoma 2)和NLRC4(NLR-family CARD-containing protein 4)等炎癥小體的激活；研究顯示[13]，抑制Ca2+信號能夠阻斷NLRP3炎癥小體的活化，但對AIM2和NLRC4等炎癥小體的活化沒有影響；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)作為細胞內(nèi)鈣離子的主要存儲庫，似乎對Ca2+信號參與的NLRP3炎癥小體激活的過程至關(guān)重要[13]，因為藥理抑制或敲低肌醇1，4，5-三磷酸受體(IP3R)上的小發(fā)卡RNA(shRNA)可以阻斷Ca2+動員以及NLRP3炎癥小體的活化[14]。

2.2.3 線粒體功能障礙與活性氧(ROS)途徑

相關(guān)研究[15]得出，大量的NLRP3激動劑都能加快活性氧的產(chǎn)生，炎癥小體活化所需的ROS是由線粒體產(chǎn)生的。早期的研究[16]發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)正常負電位降低引起的線粒體功能障礙與NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)，線粒體DNA也參與了NLRP3炎癥小體的活化，心臟磷脂是一種線粒體特異性磷脂，通常位于線粒體內(nèi)膜，可移位至線粒體外膜，與NLRP3的LRRs結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體。以上機制參與炎癥小體的活化仍然存有很多說法，有待進一步研究。

3 NLRP3炎癥小體與哮喘氣道炎癥的關(guān)系

NLRP3炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以被多種物質(zhì)激活，介導(dǎo)caspase-1激活和促炎細胞因子IL-18/IL-1β的分泌，以應(yīng)對微生物感染和細胞損傷。然而，NLRP3炎性小體的異常激活已被證實與多種炎癥疾病有關(guān)。越來越多的研究表明NLRP3炎性小體在哮喘的氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用。

3.1 臨床樣本

有研究顯示炎癥小體在感染加重中被過度活化，在特應(yīng)性哮喘患者先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。哮喘和特應(yīng)性疾病的發(fā)生與先天性免疫反應(yīng)中炎癥小體功能下降有關(guān)，哮喘患者的先天性免疫功能受損而導(dǎo)致呼吸道微生物感染的概率增加。病毒和細菌都與哮喘發(fā)作有關(guān)，導(dǎo)致哮喘癥狀惡化和肺功能下降，甚至危及生命。炎癥小體在感知外部損傷(如病毒和細菌)并據(jù)此作出反應(yīng)中的關(guān)鍵作用亦日益受到重視。相關(guān)研究指出[18]甲型流感病毒感染的哮喘患者和正常志愿者支氣管上皮細胞中炎性小體活化以及caspase-1、IL-6，TNFα、IL-1β等表達增強，提示支氣管上皮細胞炎性小體的活化可能參與了病毒誘導(dǎo)的哮喘加重的發(fā)病機制。

3.2 體外研究

NLRP3炎癥小體可以被多種危險信號激活，其活化后釋放的白介素18、白介素1β等炎癥因子引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮著重要的作用。研究證實[2]，NLRP3炎癥小體在人類支氣管上皮細胞(NHBE)原代培養(yǎng)的細胞中通過炎性刺激可以誘導(dǎo)IL-1β和NLRP3蛋白表達；PM暴露通過NLRP3依賴機制誘導(dǎo)活化的胸內(nèi)淋巴結(jié)樹突狀細胞數(shù)量增加，氣道上皮細胞NLRP3炎癥小體活化，IL-1β表達顯著增強[1]；抑制LPS刺激的骨髓源性單核細胞(BMDCs)中NLRP3炎性小體的活化可降低氣道炎癥反應(yīng)，并阻斷Th2、Th17的極化[19]。這些結(jié)果表明不同物質(zhì)引起的NLRP3炎癥小體活化參與了哮喘氣道炎癥。

3.3 體內(nèi)研究

Chen等[20]通過甲苯二異氰酸酯(TDI)復(fù)制哮喘小鼠模型發(fā)現(xiàn)，TDI暴露引起NLRP3和caspase-1的表達增強，氣道高反應(yīng)性(AHR)、中性粒細胞浸潤、杯狀細胞上皮化增生、膠原沉積和TH2/TH17反應(yīng)的增加。特異性caspase-1抑制劑VX-765、Ac-YVAD-CHO和高選擇性NLRP3抑制劑MCC950有效抑制TDI誘導(dǎo)的NLRP3和caspase-1活化，顯著減輕氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、氣道重構(gòu)、TH2/TH17反應(yīng)和caspase-1、IL-1β及IL-18的蛋白表達。Ather等[21]證實，血清淀粉樣蛋白A刺激C57/BL6小鼠通過TLR2信號活化NLRP3炎癥小體，進一步誘導(dǎo)IL-1β分泌，從而參與過敏性氣道炎癥。暴露在臭氧環(huán)境下的C57/BL6小鼠出現(xiàn)線粒體功能障礙和NLRP3炎癥小體激活，非線粒體活性氧機制導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化在臭氧誘導(dǎo)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的發(fā)生機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。七氟醚可通過抑制Th2反應(yīng)和NLRP3表達改善卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥[23]。暴露MWCNT(一種活化NLRP3炎性小體的納米工程材料)24h，能有效誘導(dǎo)野生型小鼠急性肺部炎癥，顯著提高氣道阻力，該作用在IL-1R-/-小鼠中被阻斷；暴露MWCNT 28d后，與野生型小鼠相比，最初在IL-1R-/-小鼠中被阻斷的炎癥反應(yīng)顯著增強，該研究被認為是NLRP3炎性小體參與變應(yīng)性哮喘的最具說服力的證據(jù)[24]。

目前皮質(zhì)類固醇是治療哮喘的一線藥物，而由固有免疫系統(tǒng)蛋白(如TLRs和NLRP3炎性小體等蛋白)激活所驅(qū)動的中性粒細胞哮喘對皮質(zhì)類固醇不敏感或耐藥。研究表明[25]中性粒細胞引起的氣道炎癥反應(yīng)以及對類固醇耐藥反應(yīng)都與NLRP3和IL-1β蛋白表達密切相關(guān)，NLRP3炎性小體活化導(dǎo)致嚴(yán)重的類固醇耐藥性哮喘，NLRP3抑制劑MCC950改善了類固醇抵抗性哮喘的特征。NLRP3炎性小體有望為研究不同類型哮喘的發(fā)病機制提供思路。

4 總 結(jié)

綜上所述，NLRP3炎性小體與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其確切作用仍有待闡明。進一步研究炎性小體對先天免疫和適應(yīng)性免疫的作用，將具有重要意義。特異性抑制NLRP3炎癥小體及相關(guān)信號通路是支氣管哮喘防治研究的重要新方向。