多指標(biāo)正交試驗篩選用煎藥機煎煮牡蠣散的最佳工藝

顧小晶，吳秋燕，黃玉宇

（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000）

中藥湯劑是指將中藥飲片或粗顆粒加水煎煮或用沸水浸泡后，去渣取汁而得到的液體制劑。中藥湯劑在臨床上使用廣泛，充分適應(yīng)中醫(yī)辨證論治、隨證加減的原則。由于患者自行煎煮中藥湯劑較麻煩，故很多患者選擇在醫(yī)院代煎中藥。目前，我國尚未建立全面的中藥湯劑機器煎煮技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)體系，具體的煎煮規(guī)范仍由各家醫(yī)院自主制定。因此，本文中我們選用牡蠣散作為代表方劑，采用YJD 型“十功能自動煎藥機”（該系列煎藥機能滿足《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中關(guān)于中藥煎煮的要求），開展中藥湯劑專業(yè)煎煮方面的相關(guān)研究。牡蠣散出自宋代陳師文所著《太平惠民和劑局方·卷之八治雜病》一書中，由牡蠣、黃芪、浮小麥、麻黃根四味藥材組成，具有固表止汗、益氣斂陰的功效[1]。牡蠣散是固澀劑的代表方之一。本試驗以牡蠣散煎劑中浸出物、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及碳酸鈣的含量為綜合性評價指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗確定采用煎藥機煎煮牡蠣散的最佳工藝，為制定標(biāo)準(zhǔn)的中藥湯劑機器煎煮規(guī)范提供依據(jù)。

1 材料與試藥

YJD-20GL 型十功能自動煎藥機（由北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司生產(chǎn)），Shimadzu LC-20AB 高效液相色譜系統(tǒng)（由日本島津公司生產(chǎn)），RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（由瑞士BUCHI 公司生產(chǎn)）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號為20633-67-4，由中國藥品生物制品檢定所提供），高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）級乙腈、磷酸、乙醇、甲醇為分析純。本試驗所用的牡蠣、黃芪、麻黃根、浮小麥飲片均購自蘇州天靈中藥飲片有限公司，并經(jīng)我院國家中藥傳承人沈多榮主任中藥師鑒定確認(rèn)其品質(zhì)合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 牡蠣散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Pack c4 （250 mm×4.6 mm，5 μm）（YMC Co. Ltd，Japan）；流動相：乙腈（B）-0.1%磷酸水（A）溶液，梯度系統(tǒng)0 ～20 min，20%～40%B；20 ～25 min，40%～20%B；流速：1 mL/min；檢測波長：315 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[2-3]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液的色譜圖（檢測方法為HPLC法）見圖1。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的HPLC 色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品8.3200 mg，置于10 mL 的容量瓶中，加入適量甲醇溶解、定容至刻度，配置成0.8320 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4 ℃的冰箱中存放備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取100 mL 的牡蠣散湯劑溶液，加入60 mL 的乙醇，混合均勻后置于4 ℃的冰箱中靜置24 h。24 h 后對液體進(jìn)行濾過，蒸干濾液，用甲醇超聲溶解殘渣，定容至100 mL 的容量瓶中，將其作為供試品溶液，并置于4 ℃的冰箱中存放備用。

2.1.4 方法學(xué)考察 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密量取“2.1.2 項”下 的 對 照 品 溶 液2 mL、1.5 mL、l mL、0.5 mL、0.3 mL，置 于5 mL 的 容 量 瓶 中，加 入 甲 醇定容至刻度，搖勻后按上述色譜條件進(jìn)行測定。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到回歸方程Y=7498699X-153955，R2=0.9994。這表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.04992 ～0.3328 mg/mL 的范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2）精密度試驗。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次（測定方法及色譜條件同上），計算得到樣品中毛蕊

異黃酮葡萄糖苷含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.98%。這表明，該檢測方法的精密度良好。3）穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、16 h、24 h 進(jìn)樣測定（測定方法及色譜條件同上），計算得到樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD 為2.98%。這表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。4）重復(fù)性試驗。取同一批號樣品6 份，按上述供試品溶液的制備方法制備成6 份供試品液，分別進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定（測定方法及色譜條件同上），計算得到樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD 為2.10%。這表明，該樣品的重復(fù)性很好。5）加樣回收率試驗。稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷一半處方量的組方飲片進(jìn)行煎煮，加入牡蠣散處方量一半的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，按上述樣品制備方法制備牡蠣散樣品溶液6 份。精密吸取各樣品溶液10 μL 進(jìn)樣測定（測定方法及色譜條件同上），計算得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為96.98%，RSD 為1.27%。

2.2 牡蠣散中碳酸鈣含量的測定方法

精密稱取牡蠣散湯劑溶液50 mL，加入50 mL 的無水乙醇進(jìn)行醇沉處理，放置一夜后精密量取上清液25 mL。先后在上清液中加入10% 的三乙醇胺10 mL、水50 mL，用1 mol/L 的氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）將上清液的酸堿度（potential of hydrogen，pH）調(diào)至13（顯黃色）。之后在其中加入少量的鈣黃綠素指示劑，并用0.05 mol/L的乙二胺四醋酸二鈉滴定液滴定至溶液中黃綠色熒光消失并顯示橙色。計算供試品中碳酸鈣的含量。

2.3 牡蠣散中浸出物含量的測定方法

按《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）中規(guī)定的浸出物測定法[4]，用干燥的濾器濾過牡蠣散水煎液，精密量取25 mL 的濾液，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中。對濾液進(jìn)行水浴后蒸干，于105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min 后進(jìn)行稱量，用減量法計算浸出物的含量。

2.4 煎煮工藝的單因素考察

2.4.1 煎煮工藝對牡蠣散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響 為篩選蠣散最佳的機器煎煮工藝，在查閱中藥煎煮相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素考察，以牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量為考察指標(biāo)。

2.4.2 浸泡時間對牡蠣散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響 取煅牡蠣120 g、黃芪120 g、麻黃根27 g、浮小麥240 g，加水3500 mL，分別浸泡0 min、10 min、20 min、30 min、40 min。煎煮20 min 后進(jìn)行濾過處理，并定容至2000 mL。測量各煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量。結(jié)果顯示，隨著浸泡時間的增加，煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量都呈先升后降、再升再降的趨勢；在浸泡30 min 的情況下，檢測出上述三種成分的含量最高。見圖2。因此本試驗選取浸泡20 min、30 min、40 min這三個浸泡時間進(jìn)行正交試驗考察。

圖2 不同浸泡時間對牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響

2.4.3 煎煮時間對牡蠣散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響 在其他煎煮條件不變的情況下，考察分別煎煮10 min、15 min、20 min、25 min、30 min時牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量。結(jié)果顯示，隨著煎煮時間的增加，牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量基本呈升高趨勢。見圖3?？紤]實際生產(chǎn)時間、成本等因素，本試驗選取煎煮20 min、25 min、30 min 這三個煎煮時間進(jìn)行正交試驗考察。

圖3 不同煎煮時間對牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響

2.4.4 煎煮溫度對牡蠣散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響 在其他煎煮條件不變的情況下，分別考察煎煮溫度為105℃、110℃、115℃、120 ℃時牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量。

結(jié)果顯示，隨著煎煮溫度的增加，牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量基本呈降低趨勢。見圖4。故本試驗選取105 ℃、110℃、115 ℃這三個煎煮溫度進(jìn)行正交試驗考察。

圖4 不同煎煮溫度對牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物含量的影響

2.5 煎藥機煎煮工藝的正交試驗設(shè)計及結(jié)果

依據(jù)單因素考察結(jié)果，以牡蠣散水煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗（L9）[5-8]：A 為浸泡時間（20 min、30 min、40 min），B 為煎煮時間（20 min、25 min、30 min），C 為煎煮溫度（105 ℃、110 ℃、115 ℃）。根據(jù)“2.1.3 項”制備正交試驗中的9 組供試品溶液，并分別測定其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、碳酸鈣及浸出物的含量。本試驗選擇綜合加權(quán)評分法對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，加權(quán)評分=（浸出物含量/ 樣品中最高浸出物含量）×50+（毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率/ 樣品中最高毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率）×30+（碳酸鈣含量/ 樣品中最高碳酸鈣含量）×20。將計算得到的總分帶入正交試驗中，結(jié)果如表1 所示?？梢姡饕蛩貙δ迪犐C器煎煮工藝的影響從小到大依次為C ＜A ＜B，即煎煮溫度＜浸泡時間＜煎煮時間。故浸泡時間、煎煮時間對牡蠣散機器煎煮工藝的影響較大，考慮可能與“牡蠣質(zhì)體重墜”有關(guān)。用SPSS 15.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對以上結(jié)果進(jìn)行方差分析表明，煎煮時間因素的F值為23.46，P值為0.0409。故煎煮時間對牡蠣散的機器煎煮工藝有顯著性影響。詳見表2。按照臨床煎藥的可行性，并綜合正交試驗的結(jié)果和方差分析，確定牡蠣散的最佳機器煎煮工藝為A3B3C2，即將牡蠣散飲片浸泡40 min 后，用煎藥機在110 ℃的條件下煎煮30 min。

表1 牡蠣散機器煎煮工藝正交試驗表及結(jié)果

表2 牡蠣散機器煎煮工藝試驗的方差分析表

2.6 驗證試驗

稱取牡蠣散處方量飲片，按照最佳的機器煎煮工藝進(jìn)行3 次驗證試驗，并與傳統(tǒng)煎煮工藝進(jìn)行比較。傳統(tǒng)的砂鍋煎煮法是：稱取煅牡蠣120 g、黃芪120 g、麻黃根27 g、浮小麥240 g，加水3500 mL，浸泡40 min 后先用武火加熱，待水沸騰后改用文火煎煮30 min。30 min 將煎液濾出，定容至2000 mL，即得到傳統(tǒng)工藝煎煮湯劑。測定傳統(tǒng)工藝煎煮湯劑中浸出物、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及碳酸鈣的含量。結(jié)果顯示，與采用傳統(tǒng)砂鍋煎煮法相比，采用機器煎煮法（按最佳機器煎煮工藝進(jìn)行煎煮）進(jìn)行煎煮時牡蠣散煎劑中浸出物、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和碳酸鈣的含量均更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。在最佳機器煎煮工藝條件下，牡蠣散煎劑中浸出物、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和碳酸鈣的含量均高于正交試驗中9 個試驗的結(jié)果，且RSD均在3%以內(nèi)。這表明，本試驗篩選出的機器煎煮工藝穩(wěn)定、合理、可靠。

表3 不同煎煮方法下牡蠣散煎劑中浸出物、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及碳酸鈣的含量

3 討論

中醫(yī)在使用中藥飲片時必須掌握正確的煎煮方法，中藥飲片煎煮的好壞會直接影響其藥效及患者的療效。李時珍在《本草綱目》中說：“凡服湯藥，雖品物專精，修治如法，而煎煮者魯莽造次，水火不良，火候失度，則藥亦無功[9]?！币虼?，要使中藥湯劑發(fā)揮最大的功效，必須嚴(yán)格掌握其煎煮工藝。在牡蠣散中，黃芪、牡蠣為核心藥對，其在牡蠣散及其類方中是密不可分的，發(fā)揮著重要的治療作用[1]。黃芪中的主要藥物活性成分為毛蕊異黃酮葡萄糖苷（黃酮苷類），因此本試驗將該成分的含量作為考察指標(biāo)之一。牡蠣較為特殊，既是動物藥，又需要先煎，符合本試驗對不同類型方劑、不同種類和不同藥用部位中藥飲片及不同類型有效成分的選擇原則。本試驗將牡蠣中所含的碳酸鈣（無機鹽類）作為另一個指標(biāo)進(jìn)行考察，最后結(jié)合浸出物含量進(jìn)行研究。從本試驗的結(jié)果可以看出，影響牡蠣散機器煎煮工藝的因素依次是煎煮時間、浸泡時間、煎煮溫度。煎煮時間是影響牡蠣散機器煎煮工藝的主要因素，且機器煎煮法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的砂鍋煎煮法。

本試驗篩選出的用煎藥機煎煮牡蠣散的最佳工藝為：將牡蠣散飲片浸泡40 min 后，用煎藥機在溫度為110 ℃的條件下煎煮30 min。該結(jié)果不僅能為牡蠣散及此類中藥方劑的機器煎煮提供參考標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量保障，還可為本院的中藥代煎工藝提供一定的依據(jù)。