• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    橡膠樹炭疽病生防內(nèi)生菌的分離鑒定及抑菌作用研究

    2021-12-08 06:40:56李嵐嵐,戴利銘,蔣桂芝,劉一賢,施玉萍,蔡志英
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定

    李嵐嵐,戴利銘,蔣桂芝,劉一賢,施玉萍,蔡志英

    摘? 要:目前化學(xué)農(nóng)藥的缺點(diǎn)日益突顯,研發(fā)環(huán)保的生防菌劑是當(dāng)前綠色安全的一種方法,篩選具有抑制橡膠樹炭疽病的生防菌株,為研發(fā)新型生防菌劑儲(chǔ)備資源。本文采用組織培養(yǎng)法分離純化橡膠樹內(nèi)生菌,平板對(duì)峙篩選拮抗菌株;通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化、根據(jù)16S rRNA和gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其分類地位;采用平板對(duì)峙法研究?jī)?nèi)生菌株的抗菌持久性、穩(wěn)定性、廣譜性;采用牛津杯法研究拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性。從橡膠樹健康的根組織中分離得到4株對(duì)橡膠樹炭疽病具有抑制作用的細(xì)菌(Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4),系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示這4株細(xì)菌與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)親緣關(guān)系很近,且培養(yǎng)性狀和生理生化特征也與解淀粉芽孢桿菌相似。這4株內(nèi)生菌的抗菌持久性強(qiáng),抗菌穩(wěn)定性好;對(duì)尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)DFMP1E和MLZZP3、小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)MF375898均有較強(qiáng)的抑菌能力,對(duì)茄類鐮刀菌(Fusarium solani)XJ160901的抑制作用較弱;對(duì)多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑4種殺菌劑均不敏感,有望開發(fā)為生防菌劑。

    關(guān)鍵詞:橡膠樹炭疽病;解淀粉芽孢桿菌;生防內(nèi)生菌;分離鑒定

    中圖分類號(hào):S763.7;S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    Isolation, Identification and Bacteriostasis Study of Endophytic Bacteria to Control Colletotrichum Leaf Disease on Rubber Tree

    LI Lanlan, DAI Liming, JIANG Guizhi, LIU Yixian, SHI Yuping, CAI Zhiying*

    Yunnan Institute of Tropical Crops, Jinghong, Yunnan 666100, China

    Abstract: At present, the disadvantages of chemical pesticides are prominent and the development of environmental friendly biocontrol agent is needed. The screening of biocontrol strains with inhibition of rubber anthracnose can reserve resources for the development of new biocontrol agents. The endophyte bacteria of rubber trees were isolated and purified by tissue culture, and growth plate-confrontation was used to screen antagonistic strains. Strain Bac RZS3D4-1, Bac RZS3D4-2, Bac RZS3D4-3, Bac RZS3D4-4 were identified based on morphological, physiological, biochemical characteristics and the phylogenetic tree was constructed with 16S rRNA and gyrA gene sequence. The growth plate-confrontation was used to study the antimicrobial persistence, stability and broad spectrum of endophytic bacteria. The Oxford cup method was used to study the sensitivity of antagonistic endophytic bacteria to fungicides. Four strains of bacteria (Bac RZS3D4-1, Bac RZS3D4-2, Bac RZS3D4-3, Bac RZS3D4-4) were isolated from the healthy root tissues of rubber trees. Phylogenetic tree analysis showed that the four strains were closely related to Bacillus amyloliquefaciens, and the culture traits and physiological and biochemical characteristics were similar to those of B. amyloliquefaciens. The results showed the strains had strong antibacterial persistence and good antibacterial stability, strong antibacterial activity against Colletotrichum acutatum (DFMP1E and Mlzzp3) and Pestalotiopsis microspora (MF375898), and weak inhibitory effect on Fusarium solani (XJ160901). They were not sensitive to carbendazim, isocarb, chlorothalonil and difenoconazole, so it is expected to be developed as a biocontrol agent.

    Keywords: Colletotrichum leaf disease on rubber tree; Bacillus amyloliquefaciens; biocontrol endophytic microorganism; isolated identification

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.028

    炭疽病是橡膠樹上的重要病害,嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹葉片落光,膠乳產(chǎn)量下降[1]。橡膠樹炭疽病在世界各國植膠區(qū)均有發(fā)生,廣泛分布于南美洲、非洲中部、亞洲南部和東南部等地[2]。主要是由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)引起的,近年來在國內(nèi)外廣泛流行,發(fā)病趨勢(shì)日益嚴(yán)重,導(dǎo)致橡膠產(chǎn)業(yè)損失逐年增加[3-5]。橡膠樹炭疽病危害膠苗、大田幼樹和開割膠樹,侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實(shí)等多個(gè)部位,引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實(shí)腐爛等,嚴(yán)重時(shí)引起膠樹重復(fù)落葉和嫩梢回枯,導(dǎo)致開割時(shí)間推遲[2-4]。橡膠樹炭疽病在西雙版納地區(qū)膠苗苗圃中每年均有發(fā)生,1963—1964年,景洪農(nóng)場(chǎng)的實(shí)生苗和芽接苗上就發(fā)生了此病,造成嚴(yán)重落葉、嫩梢回枯,之后每年該病在橡膠苗圃均有不同程度的發(fā)生[3-8]。

    目前,橡膠樹炭疽病的防治主要以化學(xué)藥劑結(jié)合農(nóng)業(yè)防治措施為主。農(nóng)業(yè)防治措施包括改善苗圃陰濕環(huán)境、合理施肥,提高膠苗抗病能力;開割膠林,清理枯枝落葉及林間雜草,修剪枝葉,改善膠林通風(fēng)和光照條件等。通過改善膠樹生長環(huán)境,提高膠樹的抗病能力[1, 9-10]。農(nóng)業(yè)防治措施難以大面積推廣,且只能在短期內(nèi)局部控制病情的蔓延。選用以多菌靈為代表的苯并咪唑類農(nóng)藥和以咪鮮胺為代表的麥角甾醇類生物合成制劑及其復(fù)配劑作為化學(xué)防治的主要藥劑[5, 10-13]。然而如果不科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥,或是長期大量使用單一化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病害防治,容易造成防效下降及抗藥性等問題,并且大量使用化學(xué)農(nóng)藥也會(huì)對(duì)土壤和水資源造成嚴(yán)重污染,對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成破壞[14-15]。目前,已報(bào)道的防治炭疽病的生防菌種類較多,以芽孢桿菌和放線菌研究最為廣泛,芽孢桿菌中又以枯草芽孢桿菌為主,已經(jīng)在病害防治上得到廣泛應(yīng)用,多應(yīng)用于蔬菜瓜果及糧食作物病害的防治[16-19]。梁艷瓊等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠樹根病病菌和橡膠樹炭疽病菌具有一定的抑制效果,樊蘭艷[19]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1產(chǎn)生的脂肽類粗提物對(duì)橡膠樹炭疽病有抑制作用;劉一賢等[21]發(fā)現(xiàn)桑樹鏈霉菌對(duì)橡膠樹褐根病、白根病等具有抑制作用。

    隨著人們環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)和生產(chǎn)需求的不斷發(fā)展,化學(xué)農(nóng)藥的缺點(diǎn)日益突顯,尋求高效、環(huán)保且行之有效的防治方法勢(shì)在必行[14-15]。因此對(duì)橡膠樹炭疽病生防菌的開發(fā)利用顯得尤為重要,植物內(nèi)生菌是生防菌的重要來源,所以研究橡膠樹內(nèi)生菌具有重要意義。本研究從橡膠樹組織中篩選具有生防作用的內(nèi)生菌,并對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定;同時(shí)研究拮抗菌對(duì)尖孢炭疽菌的抗菌持久性、穩(wěn)定性、抑菌譜和對(duì)殺菌劑的敏感性,為研發(fā)新型生防菌劑儲(chǔ)備資源。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    1.1.1? 供試樣品? 從云南省紅河(河口、金平)、景洪等植膠區(qū)采集橡膠樹莖干、根等組織(選取成年老橡膠樹),使用打孔器在樹干和根上鉆孔獲取組織樣品,裝入自封袋,填寫標(biāo)簽,封好袋子,帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

    1.1.2? 培養(yǎng)基? Luria-Bertani培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar)、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar)、NYD培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基、PGY培養(yǎng)基、TGE培養(yǎng)基[22-24]。

    1.1.3? 主要試劑? 細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bacteria Genomic Kit):北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;PCR引物:北京六合華大基因科技有限公司合成;葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、瓊脂等分析純?cè)噭荷ど锕こ蹋ㄉ虾#┕煞萦邢薰?50%多菌靈可濕性粉劑:江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司,75%百菌清可濕性粉劑:先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司,50%異菌脲可濕性粉劑:蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑:先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。

    1.1.4? 供試菌株? 尖孢炭疽病菌株(C. acutatum):菌株編號(hào)DFMP1E和MLZZP3,膠孢炭疽病菌(C. gloeosporioides):菌株編號(hào)NPS1a-2,棒孢霉落葉病菌(Corynespora cassiicola):菌株編號(hào)JCMP7A,橡膠樹褐根病菌(Phellinus noxius):菌株編號(hào)JPNC4,小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora):菌株編號(hào)MF375898,橡膠疫霉(Phytophthora heveae):菌株編號(hào)OJ20180523,五隔大無性孢麗赤殼菌(Calonectria pentaseptata):菌株編號(hào)OJ20180629,茄類鐮刀菌(Fusarium solani):菌株編號(hào)XJ160901,以上靶標(biāo)病原菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

    1.2? 方法

    1.2.1? 內(nèi)生菌的分離與純化? 將從植膠區(qū)采集的健康橡膠樹組織洗凈,用0.1%升汞溶液和75%酒精表面消毒,用滅菌水反復(fù)沖洗,吸干表面水份,去掉植物組織最外層,切成小塊,分別放入LB、PDA和高氏1號(hào)平板培養(yǎng)基中培養(yǎng),以最后一次清洗植物組織的滅菌水作為對(duì)照[25-28]。將平板放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),1~2 d后取出LB平板,挑取單菌落劃線接種到新的LB平板,并編號(hào);4~5 d后取出PDA和高氏1號(hào)平板,挑取單菌落分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基上,并編號(hào)。純化后分別于斜面4 ℃保存、甘油管–80 ℃保存[29]。

    1.2.2? 拮抗內(nèi)生菌初篩和復(fù)篩? 以尖孢炭疽菌株MLZZP3和膠孢炭疽菌株NPS1a-2作為指示菌,采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩,觀察有無抑菌帶,篩選出具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌[30-31]。

    對(duì)初篩得到的有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩,采用平板對(duì)峙法,以只接病原菌作為對(duì)照,培養(yǎng)7 d后,計(jì)算指示菌抑菌率。抑制率=(對(duì)照組菌落生長直徑–處理組菌落生長直徑)/(對(duì)照組菌落生長直徑–接種菌塊直徑)×100%[15, 30-32]

    1.2.3? 拮抗內(nèi)生菌的鑒定? 菌落形態(tài)特征:將拮抗內(nèi)生菌Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4分別接種在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE等培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d,觀察4株內(nèi)生菌的菌落形態(tài)。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[34]的方法,對(duì)拮抗菌進(jìn)行革蘭氏染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果和菌株形態(tài)。

    生理生化指標(biāo):參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[34]的方法,對(duì)拮抗菌的M.R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原、脂酶試驗(yàn)、明膠水解、反硝化、檸檬酸鹽利用等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

    系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征:提取菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的基因組總DNA,采用16S rRNA基因的通用引物對(duì)提取的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)采用引物gyrA-F(5-CAGTCAGGAAA TGCGTACGTCCTT-3)和gyrA-R(5-CAAGGTA ATGCTCCAGGCATTGCT-3)對(duì)gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增[35-37]。

    1.2.4? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌持久性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌,采用平板對(duì)峙法,以只接種指示菌作為對(duì)照,28 ℃恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)5、10、15、20、25、30 d后,測(cè)量指示菌菌落直徑,計(jì)算指示菌的抑菌率[38-39]。

    1.2.5? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌穩(wěn)定性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌,采用平板對(duì)峙法,將拮抗菌在培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接多代,以不同代的拮抗菌作為處理,以只接種指示菌的處理作為對(duì)照,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后,計(jì)算指示菌的抑菌率[40-41]。

    1.2.6? 拮抗內(nèi)生菌抗菌譜研究? 以菌株編號(hào)為DFMP1E、MLZZP3、NPS1a-2、JCMP7A、JPNC4、MF375898、OJ20180523、OJ20180629、XJ160901的9個(gè)病原菌作為指示菌,采用平板對(duì)峙法,計(jì)算指示菌的抑菌率,評(píng)價(jià)拮抗菌的抗菌廣譜性[38, 42-43]。

    1.2.7? 拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性? 牛津杯法測(cè)4株拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)多菌靈(1388.9 mg/kg)、異菌脲(694.4 mg/kg)、百菌清(2777.8 mg/kg)、苯醚甲環(huán)唑(200 mg/kg)的敏感性,每個(gè)處理重復(fù)3次,以加無菌水的處理作為對(duì)照,28 ℃恒溫培養(yǎng)1~2 d后,觀察是否產(chǎn)生抑菌圈[44-45]。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 內(nèi)生菌的分離與純化

    從云南省植膠區(qū)紅河(河口、金平)、景洪等地采集橡膠樹根、莖干組織樣品共25份,分離得到156株菌,其中64株真菌,92株細(xì)菌。

    2.2? 拮抗內(nèi)生菌的初篩和復(fù)篩

    通過平板對(duì)峙法對(duì)分離得到的156株內(nèi)生菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩,篩選得到4株對(duì)炭疽病菌有較好抑制作用的細(xì)菌菌株(圖1),分別編號(hào)為:Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4。結(jié)果顯示4株菌對(duì)供試病原真菌都具有抑制作用,對(duì)尖孢炭疽病菌MLZZP3(C. acutatum)的抑菌率分別為74.80%、62.59%、75.47%、74.35%,對(duì)膠孢炭疽病菌NPS1a-2(C. gloeosporioides)的抑菌率分別為59.52%、47.48%、61.87%、60.78%。

    2.3? 拮抗內(nèi)生菌的鑒定

    2.3.1? 菌落形態(tài)特征? 拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE 7種供試培養(yǎng)基中均能良好生長,但在不同的培養(yǎng)基上菌落形態(tài)有差異(表1)。4株菌革蘭氏染色均為陽性,菌體呈桿狀,兩端鈍圓。

    2.3.2? 生理生化特征? 菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的生理生化特征如表2所示,4株菌的甲基紅試驗(yàn)均為陰性,V-P試驗(yàn)均為陽性,均能產(chǎn)生過氧化氫酶、淀粉水解酶,均能使硝酸鹽還原、明膠水解,均不產(chǎn)生脂酶,均能夠利用檸檬酸鹽,反硝化反應(yīng)均為陽性。

    2.3.3? 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征? 用16S rRNA基因通用引物對(duì)4株拮抗菌株進(jìn)行序列擴(kuò)增并測(cè)序,得到1400 bp左右的序列,將序列提交到GenBank,獲得登錄號(hào)分別為MT747964、MT747965、MT747966、MT747967,經(jīng)BLAST比對(duì),選取覆蓋度和相似性較高且有效發(fā)表的菌株進(jìn)行16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),從聚類結(jié)果可以看出4株拮抗菌株與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)聚在同一個(gè)分支上。16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示4株菌株均屬于芽孢桿菌。

    gyrA基因序列提交到GenBank,獲得登錄號(hào)分別為MW041644、MW041643、MW041642、MW041641。菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的gyrA基因序列與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18的gyrA基因序列同源性較高,與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18屬同一分支(圖2)。

    綜合拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4- 2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色、生理生化指標(biāo)與16S rRNA基因序列和gyrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析,將拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。

    2.4? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌持久性研究

    培養(yǎng)30 d,對(duì)照組病原菌菌落直徑從5 mm增長到86.10 mm,接種拮抗菌株Bac RZS3D4-1的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到27.06 mm,接種Bac RZS3D4-2的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到35.34 mm,接種Bac RZS3D4-3的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到24.91 mm,接種Bac RZS3D4-4的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到27.43 mm。以上數(shù)據(jù)表明,培養(yǎng)30 d后接種拮抗菌株的處理病原菌菌落的增長速度明顯小于對(duì)照組,表明4株拮抗菌株均能持久抑制病原菌的生長。

    拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病原菌的抑制率見表3,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,抑菌率呈先升后降的趨勢(shì),而且前期增長趨勢(shì)明顯,后期下降趨勢(shì)不明顯,后期抑制率無顯著性差異,表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)病原菌的抑制作用較持久。

    2.5? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌穩(wěn)定性研究

    拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的不同世代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用。4株拮抗菌株從第1代到第10代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑制率有一定波動(dòng),分別為:菌株Bac RZS3D4-1的抑制率為(69.24%±0.03%)~(72.95%± 0.09%),菌株Bac RZS3D4-2抑制率為(56.69%± 0.58%)~(60.63%±0.21%),Bac RZS3D4-3的抑制率為(68.81%±0.23%)~(71.64%±0.33%),Bac RZS3D4-4的抑制率為(68.94%±0.60%)~(70.43%± 0.02%)。雖然抑制率有所波動(dòng),但波動(dòng)范圍較小,表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的拮抗作用比較穩(wěn)定。

    2.6? 拮抗內(nèi)生菌抗菌譜研究

    拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)9種供試病原真菌均有抑制作用(表4),表明4株拮抗菌株的抗菌譜較廣,且菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑菌能力較菌株Bac RZS3D4-2強(qiáng)。4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E、MLZZP3和小孢擬盤多毛孢M(jìn)F375898三種病原菌的抑菌能力較強(qiáng),對(duì)茄類鐮刀菌XJ160901的抑制作用最弱。

    2.7? 拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性

    通過拮抗菌對(duì)殺菌劑的敏感性試驗(yàn),處理組和對(duì)照組的拮抗菌都正常生長,沒有產(chǎn)生抑菌圈,表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)供試的多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑在生產(chǎn)上使用的最高濃度不敏感。

    3? 討論

    本研究采用菌落形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)分離得到的內(nèi)生菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4- 3、Bac RZS3D4-4進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明4株菌株的菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)基本一致,且對(duì)4株菌的16S?rRNA基因序列和gyrA基因序列擴(kuò)增測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果僅顯示4株菌株屬于芽孢桿菌,無法確定其分類地位;通過gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)4株菌株與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)的相似度極高,綜上所述初步鑒定菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4為解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)[35-37, 46-49]。

    4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E(C. acutatum)的抑制作用呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),而且前期增長趨勢(shì)明顯,后期下降趨勢(shì)不明顯。前期處理組因拮抗菌的抑制作用,指示菌的生長速度較對(duì)照組慢,所以抑制率逐漸增加,且增幅明顯。后期由于培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基營養(yǎng)等因素的限制,抑菌率有微弱下降,但是下降趨勢(shì)不明顯,4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑菌持久性較好。

    4株拮抗菌株的不同世代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用,且抗菌穩(wěn)定性較好。4株拮抗菌株對(duì)9種供試病原真菌均有不同程度的抑制作用,抗菌譜較廣,菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑制能力較菌株Bac RZS3D4-2強(qiáng)。4株拮抗菌株對(duì)常用的4種殺菌劑(多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑)不敏感。

    菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4相較于土壤分離等其他來源的菌株具有一定優(yōu)勢(shì):(1)來源于植物組織內(nèi),與宿主長期進(jìn)化,已經(jīng)適應(yīng)了宿主的內(nèi)環(huán)境,能夠迅速在植物體內(nèi)定殖,并且穩(wěn)定生存;(2)屬于解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens),已有研究表明,解淀粉芽孢桿菌具備快速在植物體內(nèi)穩(wěn)定高效地定殖,占據(jù)病原菌的生態(tài)位點(diǎn),達(dá)到抑制植物病原菌的侵入和定殖的能力[50-58],能夠長期穩(wěn)定的達(dá)到抑制病害發(fā)生發(fā)展的作用;(3)4株菌株對(duì)殺菌劑不敏感,在開展生防菌劑的研發(fā)時(shí),可以考慮與某些殺菌劑混配。前期殺菌劑快速殺滅植物病原菌以控制病害的發(fā)生發(fā)展,但化學(xué)藥劑有效期較短,后期拮抗菌能夠在植物體內(nèi)定殖,長期穩(wěn)定地抑制病害的發(fā)生發(fā)展;并且拮抗菌定殖后,使用該菌不敏感的殺菌劑對(duì)定殖的拮抗菌也沒有影響。

    目前,雖然生防菌劑在生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,多用于蔬菜、瓜果、糧食作物類,而對(duì)于高大林木如橡膠樹等的生防菌劑的研發(fā)多停留在實(shí)驗(yàn)室階段,因環(huán)境、宿主、防效緩慢,防治時(shí)效短等因素使生防菌劑的田間應(yīng)用受到局限[16-19]。本研究主要是以離體實(shí)驗(yàn)為主,為以后的大田試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考,后期將逐步把研究重點(diǎn)放在發(fā)酵菌液大田試驗(yàn)應(yīng)用和生防菌株在植物體內(nèi)的定殖等方面。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 趙璐璐. 枯草芽孢桿菌Czk1發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其對(duì)橡膠樹炭疽病、根病生防效果初步研究[D]. 海口: 海南大學(xué), 2011.

    [2] 古? 鑫. 22種植物提取物防治橡膠樹炭疽病的研究[D]. ??冢?海南大學(xué), 2012.

    [3] 蔡志英, 黃貴修. 巴西橡膠樹炭疽病研究進(jìn)展[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(1): 89-93.

    [4] 李加智, 張春霞, 何明霞. 云南橡膠樹葉炭疽病病狀及發(fā)生近況[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技, 2008(3): 13-16.

    [5] 蔡志英, 李加智, 何明霞, 等. 三種熱霧劑對(duì)橡膠樹炭疽病大田防治試驗(yàn)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技, 2009, 32(3): 10-11.

    [6] 張春霞, 何明霞, 李加智, 等. 云南西雙版納地區(qū)橡膠炭疽病病原鑒定[J]. 植物保護(hù), 2008(1): 103-106.

    [7] 陳荃英. 橡膠炭疽菌生物學(xué)特性觀察[J]. 云南熱作科技, 1982(3): 25-27, 29.

    [8] 史學(xué)群. 橡膠樹對(duì)炭疽病抗病機(jī)制的研究[D]. 儋州: 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

    [9] 鄭? 鵬, 何? 靜, 常凱軍, 等. 橡膠樹枝條內(nèi)生真菌的分離及其拮抗性的測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2009, 30(6): 832-837.

    [10] 李? 兵, 韓開倫, 張? 云, 等. 景洪農(nóng)場(chǎng)橡膠樹炭疽病的發(fā)生及防治措施[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊, 2012(3): 200-201.

    [11] 曹學(xué)仁, 車海彥, 楊? 毅, 等. 2014年海南省橡膠炭疽病菌對(duì)多菌靈和咪鮮胺的敏感性測(cè)定[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2015, 45(6): 626-631

    [12] 殷永濤. 一種混合物對(duì)橡膠樹白粉病、炭疽病防控作用研究[D]. ??冢?海南大學(xué), 2012.

    [13] 鄭行愷. 海南省橡膠樹炭疽病監(jiān)測(cè)及其防治藥劑施用技術(shù)研究[D]. 海口: 海南大學(xué), 2019.

    [14] 張? 凱, 吳曼莉, 辜柳霜, 等. 膠孢炭疽菌生防放線菌gz-8的鑒定及生物活性初步評(píng)價(jià)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 19(6): 708-715.

    [15] 辜柳霜, 張?jiān)馒P, 張? 凱, 等. 膠孢炭疽菌生防放線菌SD-29的鑒定及抗菌活性評(píng)價(jià)[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2019, 46(4): 770-779.

    [16] 程歡歡, 余? 水, 姚偉偉, 等. 辣椒炭疽病生防芽孢桿菌的篩選及田間防效[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 53(4): 568-573.

    [17] 趙璐璐, 賀春萍, 鄭肖蘭, 等. 枯草芽孢桿菌Czk1菌株對(duì)橡膠樹根病菌的抑制作用及對(duì)炭疽病生防效果研究初報(bào)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 42(7): 740-743.

    [18] 謝? 立, 賀春萍, 梁艷瓊, 等. 枯草芽孢桿菌Czk1與化學(xué)殺菌劑協(xié)同防治橡膠樹根病[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2020, 41(8): 1625-1633.

    [19] 樊蘭艷. 橡膠樹內(nèi)生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Czk1抗菌活性物質(zhì)的初步研究[D]. ??冢?海南大學(xué), 2013.

    [20] 梁艷瓊, 唐? 文, 董文敏, 等. 枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性及其組分分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2019, 50(11): 2465-2474.

    [21] 劉一賢, 施玉萍, 戴利銘, 等. 橡膠褐根病拮抗放線菌17-7的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2020, 47(1): 118-129.

    [22] 安俊瑩. 海洋源解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌素CAMT2發(fā)酵優(yōu)化、分離及抗菌機(jī)理研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2014.

    [23] 牛世全, 耿? 暉, 閻薇如, 等. 黃芪根腐病生防放線菌篩選鑒定及其優(yōu)化培養(yǎng)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2016, 43(6): 943-950.

    [24] 郭曉平, 劉興飛, 李曉楠, 等. 泰山黃精內(nèi)生細(xì)菌的抗菌活性研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2020, 36(11): 48-54.

    [25] 陳建英, 陳肖學(xué), 羅旭璐, 等. 香竹箐栽培型古茶樹內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的拮抗活性[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2020, 35(3): 422-429.

    [26] 鄭? 旭. 馬鈴薯內(nèi)生菌的分離鑒定及抑龍葵堿功能研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2019.

    [27] 褚衍亮, 劉宇佳, 姚? 婷, 等. 一株產(chǎn)蛋白酶植物內(nèi)生菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件研究[J]. 江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 33(1): 93-99, 120.

    [28] 湯冰雪. 竹葉蘭內(nèi)生菌的分離鑒定及生物活性研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2018.

    [29] 孫愛琴. 基層微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的制備和保藏方法[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制, 2015, 31(8): 942, 945.

    [30] 常? 棟, 顧建國, 賈方方, 等. 煙草黑脛病不同植物源生防菌的篩選及防效測(cè)定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào), 26(3): 84-90.

    [31] 謝林艷, 狄義寧, 何麗蓮, 等. 甘蔗赤腐病內(nèi)生拮抗菌YC89的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2020, 60(4): 739-748.

    [32] 于地美, 黃華毅, 梁小文, 等. 一株生防真菌TRCC27001的鑒定及其抑菌特性[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 48(2): 148-154.

    [33] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 349-387.

    [34] Krieg N R, Staley J T, Brown D R, et al. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. Baltimore: Williams &Wilkins, 1986.

    [35] 荊卓瓊, 郭致杰, 徐生軍, 等. 解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的篩選鑒定及其防治番茄灰霉病效果的評(píng)價(jià)[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 29(2): 31-41.

    [36] 盧鈺升, 顧文杰, 蔣瑞萍, 等. 一株生防細(xì)菌GB58的鑒定與抑菌能力測(cè)定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(6): 198-204.

    [37] 戴利銘, 李嵐嵐, 劉一賢, 等. 解淀粉芽孢桿菌生防菌BS-3全基因組測(cè)序及生物信息分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2021, 48(6): 2073-2088.

    [38] 付紅梅. 大豆疫霉拮抗菌株的篩選、鑒定及拮抗物質(zhì)的初步分析[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

    [39] 趙旖森, 張? 亮, 盛? 浩, 等. 辣椒疫霉病生防細(xì)菌的篩選鑒定及其防效[J]. 中國蔬菜, 2019(1): 65-69.

    [40] 黃明媛. 番茄青枯病拮抗菌篩選鑒定及發(fā)酵條件研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

    [41] 代? 鵬, 張? 霞, 楊臘英, 等. 抗生素產(chǎn)生菌Streptomyces albogriseus發(fā)酵液的抗菌譜及穩(wěn)定性測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2009, 30(1): 86-89.

    [42] 胡曉丹. 禾谷鐮刀菌拮抗菌的篩選鑒定及拮抗特性研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

    [43] 汪漢成, 王茂勝, 黃艷飛, 等. 煙草青枯病拮抗菌株X-60的分離鑒定及其表型組學(xué)分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2016, 46(3): 409-419.

    [44] 閆建芳, 劉? 秋, 趙柏霞, 等. 番茄潰瘍病生防菌YH23的發(fā)酵條件優(yōu)化及菌種鑒定[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 50(5): 608-613.

    [45] 孫? 露, 單瀟瀟, 蔣建蘭, 等. 一株對(duì)稻瘟病菌有抗菌活性的特基拉芽孢桿菌 WRN032的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2020, 32(5): 860-866, 881.

    [46] 穆曉雅, 譚志瓊, 劉? 銅, 等. 一種新的黃瓜細(xì)菌性葉斑病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2019, 32(4): 837-842.

    [47] 符可芯, 楊? 葉, 曾耿狄. 熱帶土壤中解淀粉芽孢桿菌HNU1的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2020, 22(6): 49-59.

    [48] 司世飛, 宋莉莎, 任? 靜, 等. 一株抗煙草赤星病解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2018, 38(4): 410-415.

    [49] 李曉宇. 解淀粉芽孢桿菌LXY-6-2篩選、鑒定、誘變與發(fā)酵條件優(yōu)化及其對(duì)辣椒根腐病的生物防治研究[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2018.

    [50] Tan S Y, Jiang Y, Song S, et al. Two Bacillus amyloliquefaciens strains isolated using the competitive tomato root enrichment method and their effects on suppressing Ralstonia solanacearum and promoting tomato plant growth[J]. Crop Protection, 2013, 43: 134-140.

    [51] Weng J, Wang Y, Li J, et al. Enhanced root colonization and biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens SQR9 by abrB gene disruption[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2013, 97(19): 8823-8830.

    [52] 譙天敏, 張? 靜, 冉曉瀟, 等. 解淀粉芽孢桿菌在山茶葉中的定殖及對(duì)山茶灰斑病的防效[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 43(10): 77-84.

    [53] 楊洪鳳, 薛雅蓉, 余向陽, 等. 內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09菌株在小麥葉部的定殖能力及其防治白粉病效果研究[J].中國生物防治學(xué)報(bào), 2014, 30(4): 481-488.

    [54] 張? 楠, 吳? 凱, 沈怡斐, 等. 根際益生菌解淀粉芽孢桿菌SQR9在香蕉根表的定殖行為研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 37(6): 59-65.

    [55] 胡? 偉, 趙蘭鳳, 張? 亮, 等. 香蕉枯萎病生防菌AF11的鑒定及其定殖研究[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2012, 28(3): 387-393.

    [56] 王? 雪, 張丹妮, 王春偉, 等. 解淀粉芽孢桿菌FS6在人參體內(nèi)的定殖特性及對(duì)人參誘導(dǎo)抗病性[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 47(7): 125-130, 138.

    [57] 崔? 曉, 徐艷霞, 劉俊杰, 等. 芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 土壤與作物, 2019, 8(1): 32-42.

    [58] 祁? 超, 寸海春, 何鵬飛, 等. 生防菌YN201490在黃瓜植株體內(nèi)的定殖能力及防病機(jī)制的初步研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 41(1): 172-180.

    責(zé)任編輯:謝龍蓮

    猜你喜歡
    分離鑒定
    貴州薏苡黑穗病的發(fā)病情況及其病原菌的分離鑒定
    煙粉虱病原真菌的分離鑒定及生物活性初步研究
    草魚腸道不動(dòng)桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)
    五株雞傳染性支氣管炎病毒流行株的分離鑒定
    引起奶牛關(guān)節(jié)炎的牛支原體病原的分離鑒定
    江蘇1株雞傳染性貧血病毒的分離鑒定
    一株羊源腸出血性大腸桿菌的分離與鑒定
    丁鱥疑似致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性
    一株纖維素分解菌的分離鑒定及生物學(xué)特性
    重慶煙區(qū)硅酸鹽細(xì)菌的分離鑒定及生理生化特性
    久久久久久人妻| 美女福利国产在线 | 欧美区成人在线视频| 91精品国产国语对白视频| 成人国产麻豆网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 嫩草影院入口| 国产成人a∨麻豆精品| 国精品久久久久久国模美| 久久久精品94久久精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲精品视频女| 大陆偷拍与自拍| 国产伦理片在线播放av一区| 精品久久久噜噜| 免费黄网站久久成人精品| 成人二区视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费观看的影片在线观看| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产亚洲91精品色在线| 精品一区二区免费观看| 91久久精品电影网| 午夜福利网站1000一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 欧美日本视频| h视频一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美成人精品欧美一级黄| 成年人午夜在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 午夜福利视频精品| 亚洲国产精品一区三区| 日韩av免费高清视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 1000部很黄的大片| 久久国产精品大桥未久av | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 多毛熟女@视频| 多毛熟女@视频| 久久久久久久精品精品| 综合色丁香网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩av不卡免费在线播放| 成人一区二区视频在线观看| 97在线人人人人妻| 直男gayav资源| 又爽又黄a免费视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产爽快片一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久人人爽人人片av| 春色校园在线视频观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一区二区三区四区激情视频| 国产高清国产精品国产三级 | 中文字幕亚洲精品专区| 国产一级毛片在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜激情福利司机影院| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 中国国产av一级| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲国产av新网站| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美日韩在线观看h| 一区二区三区精品91| 亚洲精品aⅴ在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲在久久综合| 91精品一卡2卡3卡4卡| av视频免费观看在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产日韩欧美在线精品| 九九爱精品视频在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | freevideosex欧美| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲熟女精品中文字幕| 22中文网久久字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 九草在线视频观看| 波野结衣二区三区在线| 亚洲成色77777| 国产伦在线观看视频一区| 人人妻人人看人人澡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产av一区二区精品久久 | 日本黄大片高清| 国产av码专区亚洲av| 国产有黄有色有爽视频| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| av网站免费在线观看视频| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品人妻视频免费看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av免费观看日本| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线观看一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 黑人高潮一二区| 草草在线视频免费看| 日韩伦理黄色片| 精品国产乱码久久久久久小说| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久精品国产自在天天线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久精品国产自在天天线| 久久99热这里只有精品18| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热网站在线观看| 成人国产麻豆网| 777米奇影视久久| 精品一区在线观看国产| 成人影院久久| 久久久久久久精品精品| 一级毛片我不卡| 一本一本综合久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 免费黄网站久久成人精品| 男女无遮挡免费网站观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产探花极品一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产成人精品福利久久| 亚洲,欧美,日韩| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久久久久久久久久免费av| 成人毛片60女人毛片免费| 2022亚洲国产成人精品| 久久99热这里只有精品18| 97在线视频观看| 久久韩国三级中文字幕| 在现免费观看毛片| 国产精品蜜桃在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 免费看不卡的av| 内射极品少妇av片p| 亚洲国产高清在线一区二区三| 2022亚洲国产成人精品| 精品国产三级普通话版| 亚洲伊人久久精品综合| a级毛片免费高清观看在线播放| 99久久综合免费| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美高清成人免费视频www| 欧美高清成人免费视频www| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区精品91| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久久久久免| 久久人妻熟女aⅴ| 极品教师在线视频| 中文字幕免费在线视频6| 五月玫瑰六月丁香| 免费大片18禁| 一级毛片我不卡| 国产精品一二三区在线看| 高清毛片免费看| 久久久久久久大尺度免费视频| 嘟嘟电影网在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产视频内射| 国产久久久一区二区三区| 国产av精品麻豆| 国产 一区 欧美 日韩| www.av在线官网国产| 老司机影院毛片| 天堂8中文在线网| 精品一区二区免费观看| 少妇的逼好多水| 性色avwww在线观看| 中文字幕制服av| 国产av一区二区精品久久 | 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久人妻| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美精品专区久久| xxx大片免费视频| 嫩草影院入口| 国产精品一二三区在线看| 在线观看一区二区三区激情| 99国产精品免费福利视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 色吧在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲国产最新在线播放| 少妇熟女欧美另类| 成人美女网站在线观看视频| 看免费成人av毛片| 久久热精品热| 中国三级夫妇交换| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品久久久久久精品古装| 国产色婷婷99| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一本色道久久久久久精品综合| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 伊人久久国产一区二区| 久久这里有精品视频免费| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久九九精品二区国产| 又大又黄又爽视频免费| xxx大片免费视频| 久久 成人 亚洲| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲在久久综合| 午夜福利高清视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久久久精品精品| 少妇 在线观看| 联通29元200g的流量卡| h日本视频在线播放| av播播在线观看一区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产视频首页在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 熟妇人妻不卡中文字幕| av视频免费观看在线观看| 欧美区成人在线视频| 日韩伦理黄色片| 欧美性感艳星| 国产淫片久久久久久久久| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲性久久影院| 大话2 男鬼变身卡| 高清日韩中文字幕在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲成人一二三区av| 欧美97在线视频| 熟女电影av网| 看非洲黑人一级黄片| 超碰av人人做人人爽久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产乱人偷精品视频| 国产伦在线观看视频一区| 欧美精品一区二区大全| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av在线观看美女高潮| 人妻一区二区av| 国产精品一区二区性色av| 99久久精品热视频| 中国国产av一级| 国产69精品久久久久777片| 久久婷婷青草| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 99热国产这里只有精品6| 久久久久人妻精品一区果冻| av女优亚洲男人天堂| 国产高清三级在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久精品久久久久真实原创| av国产精品久久久久影院| a级毛色黄片| 久久这里有精品视频免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 我的女老师完整版在线观看| 久久青草综合色| 国产69精品久久久久777片| 18+在线观看网站| 国产高潮美女av| 五月玫瑰六月丁香| 午夜福利影视在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 最新中文字幕久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 99热全是精品| 97超碰精品成人国产| 在线观看免费日韩欧美大片 | 日韩电影二区| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 最近2019中文字幕mv第一页| 精品视频人人做人人爽| 国产成人精品久久久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲性久久影院| 日本与韩国留学比较| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩中字成人| 一级毛片 在线播放| 高清不卡的av网站| 秋霞在线观看毛片| 亚洲国产精品999| av免费观看日本| 国精品久久久久久国模美| 嘟嘟电影网在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品福利在线免费观看| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲精品第二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本黄大片高清| 有码 亚洲区| av女优亚洲男人天堂| 日本欧美视频一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 免费观看的影片在线观看| 观看免费一级毛片| 高清黄色对白视频在线免费看 | 我的女老师完整版在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇高潮的动态图| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产最新在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产免费一级a男人的天堂| 高清av免费在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久婷婷青草| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲最大av| 亚洲人与动物交配视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 永久免费av网站大全| 少妇的逼好多水| 五月天丁香电影| 免费看不卡的av| 国产一区二区在线观看日韩| 美女福利国产在线 | 国产精品人妻久久久久久| 国产精品成人在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 如何舔出高潮| av.在线天堂| 亚洲国产欧美人成| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产综合精华液| 久久久久久久大尺度免费视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 草草在线视频免费看| 美女cb高潮喷水在线观看| 秋霞伦理黄片| av播播在线观看一区| 免费av中文字幕在线| 欧美成人a在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩制服骚丝袜av| 黑人猛操日本美女一级片| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲人成网站在线观看播放| 一区二区三区精品91| 在线观看免费高清a一片| 免费黄频网站在线观看国产| 91久久精品电影网| 亚洲精品国产成人久久av| 午夜激情福利司机影院| 国产在线男女| 五月伊人婷婷丁香| videossex国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 男人舔奶头视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产久久久一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人午夜精彩视频在线观看| 国产黄频视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 在线观看av片永久免费下载| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 夫妻午夜视频| 妹子高潮喷水视频| 91精品国产国语对白视频| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 各种免费的搞黄视频| 久久久精品94久久精品| 免费av中文字幕在线| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 啦啦啦在线观看免费高清www| 2021少妇久久久久久久久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 中文天堂在线官网| 久久久久久久久大av| 国产成人免费观看mmmm| av卡一久久| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 日韩中字成人| 色哟哟·www| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品酒店卫生间| 一级片'在线观看视频| 一级二级三级毛片免费看| 国产人妻一区二区三区在| av专区在线播放| 永久免费av网站大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av不卡在线观看| 欧美+日韩+精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 春色校园在线视频观看| 日本黄色片子视频| 国产av码专区亚洲av| 亚洲国产av新网站| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人精品福利久久| 色婷婷av一区二区三区视频| a 毛片基地| 丝袜喷水一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费观看的影片在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 日本午夜av视频| 欧美一区二区亚洲| 国产色爽女视频免费观看| 久久人妻熟女aⅴ| 久久97久久精品| 夜夜爽夜夜爽视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲美女视频黄频| 久久久久精品性色| 亚洲高清免费不卡视频| 人妻系列 视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久午夜欧美精品| 热re99久久精品国产66热6| 99热6这里只有精品| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久精品久久久久久久性| 欧美xxⅹ黑人| 伦理电影免费视频| 婷婷色av中文字幕| 99久久精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲成人手机| 久热这里只有精品99| 网址你懂的国产日韩在线| 99热国产这里只有精品6| 一区二区三区免费毛片| 乱系列少妇在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久久视频综合| 精品一区二区三区视频在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av国产免费在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 在线播放无遮挡| 少妇人妻 视频| 少妇 在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一区二区三区精品91| 国产老妇伦熟女老妇高清| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 又大又黄又爽视频免费| 精品少妇久久久久久888优播| 99久久综合免费| 国产精品一区二区在线观看99| 九草在线视频观看| 国产精品欧美亚洲77777| 秋霞在线观看毛片| 国产男女超爽视频在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 又爽又黄a免费视频| 国产乱人视频| 老司机影院成人| 日韩成人伦理影院| 久久久国产一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久久久久久大av| 少妇熟女欧美另类| 色综合色国产| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 中国美白少妇内射xxxbb| 深爱激情五月婷婷| 在线观看一区二区三区激情| 我的女老师完整版在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 极品教师在线视频| .国产精品久久| 免费av中文字幕在线| 人妻 亚洲 视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久久久国产电影| 最近中文字幕2019免费版| 日韩大片免费观看网站| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 看十八女毛片水多多多| 国产高清国产精品国产三级 | 国产色爽女视频免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 高清不卡的av网站| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久久欧美国产精品| 欧美xxⅹ黑人| 午夜福利影视在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av国产精品久久久久影院| 久久久久国产网址| 欧美成人一区二区免费高清观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 99久国产av精品国产电影| 日本-黄色视频高清免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲性久久影院| 成人影院久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久久国产一区二区| 午夜老司机福利剧场| 国产有黄有色有爽视频| 激情 狠狠 欧美| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲国产精品国产精品| 99久久精品热视频| 国产乱来视频区| 色网站视频免费| 国产免费视频播放在线视频| 国产av一区二区精品久久 | 久久国产乱子免费精品| a 毛片基地| h视频一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久精品夜色国产| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久成人免费电影| 超碰97精品在线观看| 亚洲在久久综合| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲成人手机| 国产在线视频一区二区| 成人国产麻豆网| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 边亲边吃奶的免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av二区三区四区| 午夜福利影视在线免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看| 色综合色国产| 亚洲精品国产av成人精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲人成网站在线播| 久久久久久伊人网av| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| 久久精品国产亚洲网站| 国产 一区精品| 三级国产精品片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| av一本久久久久| 日韩成人伦理影院| 一边亲一边摸免费视频| 人妻一区二区av| 午夜福利视频精品| 国产在线免费精品| 日本欧美国产在线视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区|